基于目标诱导发夹引物聚合延伸策略荧光检测T4多聚核苷酸激酶(2)
T4 PNK是由Richards等在1965年首次从T4噬菌体侵袭大肠杆菌蛋白提取物中发现的[7]。传统的检测T4 PNK的方法主要有基态同位素32P标记法[8]、聚丙烯酰胺凝胶电泳法[9]和射线自显迹法[10]，这些方法的成本较高，现象不明显，而且有的需要特殊的仪器，有的甚至是灵敏度低、选择性较差，同位素标记法还需同位素标记其操作麻烦耗时，这些方法的缺点一定程度上限制了他们的应用范围。近年来发展了一些新型方法用于T4 PNK的检测，例如：Tang等[11]报道了一种分子信标改进以后用于实时监测T4 PNK，该方法具有灵敏度高选择性好而且还可以有效的抑制干扰信号的干扰等优点。除此之外，检测T4 PNK的方法还有发夹型荧光探针技术[12]和氧化石墨烯荧光猝灭技术[13]。荧光检测法具有灵敏度高、药品用量少、选择性好、操作简单的优点被广泛应用于检测T4 PNK的活性。而非标荧光检测方法因其具有检测速度快、成本低廉和效果明显等的特点受到很多生物学家的青睐[14]。
荧光检测方法具有灵敏度高，试样用量少，操作简单而被广泛应用。在荧光生物传感器的构建中，在有效的定量分析中嵌入荧光染料作为工具的已广泛应用于各种分析检测之中。发展新型非标荧光检测方法具有十分重要的意义。SYBR Green I (SG I) 是一种双链DNA嵌入染料，与单链DNA的结合力较弱，而与双链DNA结合后，荧光显著增强，因其具有优良的光物理性质、高灵敏度和低检出限等优点而被广泛应用于各种非标检测方法中[15]。现今SG I与DNA的非特异性结合的荧光检测方法已广泛应用于核酸[16]、金属离子[17,18]、蛋白质[19,20]等的检测。虽然DNA与荧光染料的非特异性结合会有一定的背景信号，如何降低SG I的背景信号是发展高灵敏度、简单快速、高选择性非标检测方法面临的挑战之一，但是非标检测的低成本，高灵敏度的特点还是吸引了研究者的广泛关注，而得到了广泛的应用。
本文我们基于目标T4 PNK诱导DNA发夹引物聚合延伸的原理，利用SG I做信号输出，发展了一种非标荧光传感方法检测T4 PNK的活性。3 '末端磷酸化DNA发夹引物不能发生聚合延伸反应，只有被T4 PNK去磷酸生成羟基末端才能引发聚合延伸反应，生成双链DNA产物，嵌入SG I后荧光显著增强。而DNA发夹引物与SG I的结合力较弱，只得到一个弱的背景荧光。该方法简单快速、灵敏度高、选择性好，可进一步应用于复杂生物环境中样品的分析，有助于T4 PNK活性抑制剂的筛选和DNA损伤修复机理的研究。