使用单分子荧光技术研究端粒传感器(2)
一、单分子荧光技术
1.单分子荧光技术的发展
人们一直以来就希望能在单个分子的水平上操纵物质世界。从20世纪80年代起，单分子技术得到了极大的发展，已经在各个领域发挥着关键的作用，尤其是在生命科学、化学、医学、物理学等学科上，拥有一般检测手段不具备的高灵敏度、实时性、高效性等优势。单分子技术主要通过将荧光基团标记在生物大分子上，根据其各种特性的变化得出有关分子的反应动力学、酶活性、分子间的相互作用等信息。单分子技术最主要的两种研究方法是单分子操纵技术和单分子荧光技术[5]。其中单分子操纵技术包括光镊技术、磁镊技术、原子力显微镜等[6]；单分子荧光技术能有效反应出单个分子的荧光共振能量转移（FRET）、荧光强度、荧光偏振等多方面的情况。另外单分子荧光光谱技术还可用于复杂的、多组分体系中分子的检测，能够提供更多的有用信息，增加了单分子技术的应用范围。
单分子荧光技术是单分子检测方法中最常用的，其灵敏度、空间分辨率都相当高，检测所需的样品量极少，并且能精确度纳米级别，能够直接观测单个分子，从而描述其结构变化、动力学过程及单分子间相互作用等情况，特别适合于生物大分子等方面的研究。
2.单分子荧光的产生原理
荧光产生的原理如图1所示，用分子能级图加以阐述[7]。图中S0表示分子的基态，S1、S2分别表示分子的第一、第二电子激发态单重态。当荧光物质被紫外线或可见光照射后，会吸收入射光的能量，使得分子中的电子从基态（S0）向激发态（S1或S2）跃迁。由于处在较高激发态内的电子不稳定，电子会通过振动弛豫或内转化以非辐射的方式回到第一电子激发态单重态（S1）的最低振动能级。紧接着电子从S1最低能级以辐射的方式回到基态各振动能级，在此过程中发出荧光。在最佳条件下，1个分子大约能辐射出105～106个荧光光子，使用雪崩光电二极管（APD）大约能接收到5%[8]，即可从一个荧光分子中观测到5000~50000个荧光光子，这一数目不仅满足了单个分子的探测，而且还能进行光谱识别和实时监测，完全符合单分子荧光检测的要求。
3.单分子荧光共振能量转移技术
荧光共振能量转移（FRET），又称Förster共振能量转移，是Förster在1948年首次提出的[9]，是一种发生在两个距离很近的荧光分子之间、通过偶极-偶极作用产生的能量转移现象。如果两个荧光团距离是在1～10 nm之间，并且供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的吸收光谱有重叠。当供体被入射光照射激发时，供体的能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射的方式传递给了受体，此时供体分子衰变到基态、不再发射荧光，而受体分子则先由基态跃迁至激发态, 之后再衰变到基态，会同时发射出荧光。这一过程称为荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer , FRET）。
单分子荧光共振能量转移（Single Molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer, smFRET）技术是一种将FRET检测技术与单分子荧光成像相结合的检测方法[10]，能够有效地检测生物分子结构和分子内动力学过程。该法是将两个不同的荧光基团分别作为供体和受体，标记在一个生物大分子上，并利用FRET技术进行研究。通过检测供、受体间的转移效率，可计算两个荧光基团之间距离的变化，从而确定该生物大分子构象的变化，最后得到分子内动力学过程。
4.荧光双色同步响应检测技术
上一篇：江川县星云湖主要入湖河道水质评价