（13）将产物dsRNA储存于-80℃冰箱中备用。

表 1 dsRNA 合成引物

Primer Name Forwad Primer (5’-3’) Reverse Primer(5’-3’)

DSInR1 CGCTCTGGTTGTGCTTGATA CGTTGTCTTTCTCCAACGGT

DSInR1-T7 T7-CGCTCTGGTTGTGCTTGATA T7-CGTTGTCTTTCTCCAACGGT

DSInR2 AGCTGTGCAGGGAGAA TGTT AGTCCCTTGGTACCTT TCCG

DSInR2-T7 T7-AGCTGTGCAGGGAGAATGTT T7-AGTCCCTTGGTACCTTTCCG

DSGFP ACGTAAACGGCCACAAGTTC TGTTCTGCTGGTAGTGGTCG

DSGFP-T7 T7-ACGTAAACGGCCACAAGTTC T7-TGTTCTGCTGGTAGTGGTCG

*T7序列：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’

1.3.2 褐飞虱显微注射

（1）用毛细管拉针仪制作显微注射所需的玻璃针。将玻璃毛细管拉倒适合尺寸（以针尖细长为宜），所用程序参数设定为：heat=800；pull=150；vel=150；time=80（将制作完成的玻璃针放置于带有软垫的培养基平板中，防治损坏针头）。

（2）制作琼脂糖平板。在平板中划出一道用来放置褐飞虱的凹槽。制作完成后置于冰上，并用吸水纸擦干平板表面水分，该操作可以提高注射后褐飞虱的存活率。

（3）毛细管针头准备。将处于封闭状态的毛细管的针头弄断。用显微镊在体视镜下将针尖掰断，粗细以能插入飞虱体内而针尖不弯为准。

（4）麻痹待注射的褐飞虱，用CO2 向装有褐飞虱的玻璃管中通入20 s。

（5）用柔软的小毛笔将待注射的褐飞虱挑起并放置于琼脂糖平板的浅槽中。平躺的姿势更便于对褐飞虱的注射。

（6）加样。吸10 μl dsRNA注射剂，从玻璃针后端打入。

（7）将含有dsRNA注射剂的玻璃针与显微注射仪连接。

（8）调试显微注射仪。设置显微注射仪的各项参数是：注射压强 1000 pah, 注射时间0.5 s, 补偿压20 pah。五龄若虫为注射体积为100 nl，一般选择飞虱胸部中足和后足间的外侧表皮处注射。每次注射插入玻璃针时，适当向后提一下针管，可减少堵针情况的发生。