新型N-糖酰胺酶PNGase Stca的克隆表达与特性研究(3)
本实验在大肠杆菌中对新型N-糖酰胺酶PNGase Stca进行重组表达，对其酶学性质进行探讨。试验结果将为N-糖酰胺酶的作用机制和N-糖酰胺酶分子定向进化等研究方向提供重要的科学基础和依据，进而为植物、昆虫糖组学N-糖链研究提供更经济实用的新工具，为动物细菌等生物的糖组学研究提供更多的选择。
1 实验材料
1.1 菌种
Streptomyces cattleya
1.2 主要试剂
PNGase F，上海拜力生物科技有限公司；HRP（吹冰根过氧化物酶），纯度RZ >3，南京都莱生物技术有限公司；RNase B（核糖核酸酶，纯度98%），Lactoferrin（乳铁蛋白，纯度98%），上海惠诚生物科技有限公司。
Yeast extract（酵母提取物），Tryptone（蛋白胨），OXOID公司；Tris-HCl，Glycin（甘氨酸），北京博奥拓达科技有限公司；SDS，Agar（琼脂），IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），Triton-X100，北京索莱宝科技有限公司；乙腈（分析纯），无水乙醇（分析纯），南京化学试剂股份有限公司；乙腈（色谱纯），Merck kGaA公司；冰醋酸（分析纯），NaCl（分析纯），Na2HPO4（分析纯），NiCl2•6H2O（分析纯），浓盐酸（分析纯），一水合柠檬酸（分析纯），广州华大化学试剂有限公司。PMSF（苯甲基磺酰氟），上海碧云天生物技术有限公司；咪唑（分析纯），上海安耐吉化学有限公司。
所有实验用水均为超纯水。
1.3 主要仪器设备
日本Shimadzu LC-30AD超高效液相色谱配RF-20A/20Axs荧光检测器、SIL-30AC自动进样器、LC solution 工作站；
M-6K微型离心机，杭州龙杨科学仪器有限公司；Hema 9600梯度基因扩增仪，Hema 16K台式离心机，Hema 1416R/ Hema TGL-16R高速冷冻离心机，珠海黑马医学仪器有限公司；NW Ultra-pure water system超纯水系统，力康生物医疗科技控股有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂；DYCZ-25D型双垂直电泳仪，北京市吹冰一仪器厂；DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；IMS-40型全自动雪花制冰机，常熟市雪科电器有限公司；DW-86L626海尔超低温冰箱，青岛海尔特种电器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；ZQZY-T振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；CT15RT台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司；One Drop OD-1000分光光度计，南京五义科技有限公司；TS-200脱色摇床，其林贝尔仪器制造有限公司；FA2004分析电子天平（0.0001 g）及JA31002精密电子天平（0.01 g），上海良平仪器仪表有限公司；LNG-T120真空离心浓缩干燥机，太仓华利达实验设备有限公司；DRAGONLAB 大龙 MS-S磁力搅拌器，上海万岛仪器科技有限公司；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。
多孔石墨碳柱（Supelclean™ ENVI-Carb™ SPE Tube），美国sigma公司。
2 实验方法
(一)PNGase Stca基因的合成与表达
2.1 重组质粒的转化
2.1.1 实验准备
PNGase Stca基因的合成：通过生物信息学比对，找出与PNGase A基因具有相似性的PNGase Stca基因送至金斯瑞公司进行合成。
LB液体培养基：称取5 g酵母提取物，10 g NaCl，10 g Tryptone（蛋白胨），溶解于900 mL 超纯水中，定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。
LB固体培养基：称取5 g酵母提取物，10 g NaCl，10 g Tryptone（蛋白胨），15 g Agar（琼脂），加热溶解于900 mL超纯水中，常温下定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。
Kana（卡那霉素）溶液：称取50 mg卡那霉素溶解于1 mL超纯水中，-20 ℃保存