60Co-γ射线辐照诱导下猪肉过敏原PSA致敏性与结构变化规律研究(3)
1.3 试验方法
1.3.1 γ辐照处理 称取猪肉过敏原PSA标准品500 mg，然后加入100 mL去离子水使之均匀混合，后用尼龙真空袋将其密封包装。然后在10±0.5℃条件下立即进行60Co-γ辐照处理，辐照剂量分别设定为1、3、5、7、10 kGy 6个水平，另设0 kGy为对照组。最后迅速将经辐照处理的样品冻干备用。
1.3.2 SPR方法的建立 （1）SPR生物传感器芯片制备：室温条件下，将CM5芯片浸泡于刚制备的洗液中浸泡10 min，浸泡过程中需震荡3～5次以除去芯片表面的气泡，取出后用大量去离子水冲洗，并用洗耳球吹干。整个实验过程流速设定为10 μL/min。首先将CM5芯片置于Biacore™ T200生物传感器中，待基线平稳后，依次进行以下步骤：①将50 μL 0.4 mol/L EDC和50 μL 0.1 mol/L NHS混合均匀，然后取70 μL混合物用于活化芯片；②加入100 μL 100 μg/mL羊抗PSA IgG抗体[用0.01 mmol/L PBS缓冲液（pH7.4）配制]；③用100 μL 1 mol/L盐酸乙醇胺封闭未结合抗体的位点。由以上步骤制得的芯片可直接用于检测猪肉过敏原PSA。（2）样品检测：整个实验中进样流速设为10 μL/min，检测时待测液体积为50 μL。先通入含0.05%Tween-20的0.01 mmol/L pH 7.4 PBST缓冲液，待基线稳定后通入待测样品。所得试验数据需扣除缓冲溶液背景值，所有待测样品及空白对照均检测3次。（3）芯片再生：为提高CM5生物传感器芯片的使用率，将Gly-HCl再生液以10 μL/min的流速注入检测过样品的芯片中，持续30 s，使之再生，进行抗原抗体的解离。
1.3.3 致敏性测定 先用0.01 mmol/L PBS缓冲液（pH7.4）将待测样品分别稀释至400、200、100、50、25 nmol/L 5个浓度梯度，然后以10 mmol/L Gly-HCl（pH1.5）作为再生液，将反应温度设定为25℃，采用Biacore™ T200控制软件中的动力学分析Wizard模板进行动力学试验。参照1.4.2方法，分别测定不同剂量的60Co-γ辐照处理后猪肉过敏原PSA与抗体相互作用的动力学反应，以此观察过敏原的致敏性变化情况。根据Biacore™ T200分析软件进行拟合，以时间为横坐标，响应值为纵坐标，计算抗原抗体的结合常数（ka）和解离常数（kd），然后通过kd/ka计算得出平衡解离常数（KD）[28]。抗原抗体间的固有结合力，即抗体的亲和力，可用KD值表示，其值越大，表明抗体与抗原的结合越弱。
1.3.4 CD光谱分析 在25±1℃条件下，分别将待测样品溶于0.01 mmol/L PBS的缓冲液（pH7.4）中，最后的蛋白浓度为0.05 mg/mL。测试条件：将扫描波长范围设为190～260 nm，扫描速度设为1 nm/s，光谱狭缝带宽设为1 nm。CD数据用CDNN2.1软件计算，累计扫描3次CD光谱，取平均值作为试验结果，并扫描缓冲液，扣除缓冲液信号，氨基酸残基的平均分子量按583计算。
1.3.5 紫外光谱分析 在25±1℃条件下，分别将待测样品溶于10 mmol/L PBS的缓冲液（pH7.4）中，最后的蛋白浓度为0.5 mg/mL。测试条件：扫描波长范围设为220～350 nm，扫描速度设为240 nm/min，光谱狭缝带宽设为1 nm，重复扫描3次紫外光谱后取平均值。
1.3.6 荧光光谱分析 在25±1℃条件下，分别将待测样品溶于10 mmol/L PBS的缓冲液（pH7.4）中，最后的蛋白浓度为0.05 mg/mL。测试条件：发射波长设为300～550 nm，激发波长设为295 nm，扫描速度设为1200 nm/min，光谱狭缝带宽设为10 nm，重复扫描3次荧光光谱后取平均值。
1.3.7 数据分析 方差分析（analysis of variance，ANOVA）使用SPSS17.0软件，采用0.05水平。绘图使用Microcal Origin 7.5软件（美国Microcal Software 公司）