沙门氏菌生物菌膜及其特征性sRNAs(2)
近年来，人们对非编码小RNA (small non-coding RNA, sRNA)的研究日益增多。细菌非编码小RNA (sRNA)是一类长度在几十至几百个核苷酸之间，与转录后的靶mRNA进行碱基配对，或者与调控蛋白结合的方式来调控靶基因表达的非编码RNA[7]。sRNAs在基因组中被转录但不编码功能蛋白质[8]，广泛存在于原核细菌的染色体中，只有少部分存在于噬菌体、质粒或转座子上。大多数sRNAs位于2个编码基因间的非编码区，少数sRNAs是从mRNA的5’或3’端的非转译区域剪切而来。在调控菌体响应外界环境（或宿主微环境）变化、细胞生长和新陈代谢、菌体毒力和其它生理特性过程中发挥着关键作用[9]。
作为肠道病原菌，沙门氏菌的毒力机制、微生物致病机制、基因表达和代谢途径等方面的研究已较为深入，近年来沙门氏菌已成为研究RNA介导调控的模式病原菌。目前在沙门氏菌的整个基因组范围内已能够成功鉴定sRNA的靶mRNA[10]。在标准培养基质下的沙门氏菌，其编码性mRNA对沙门氏菌生物菌膜的形成具有重要作用，细菌sRNA最普遍的机制是通过与靶mRNA配对来发挥功能，即与mRNA翻译区互补配对结合，从而影响mRNA的稳定性或者与mRNA的3’UTR结合来调控靶基因的表达和蛋白质的稳定性从而在转录水平对基因表达进行调控[11]。现已部分探明编码性mRNA可以通过CsgD系统、CsrA-BarA/SirA系统、RpoS系统和phoP/Q系统等通路[12]调节菌体的菌毛/鞭毛、外膜蛋白、移动性能、二级代谢、抗应激能力和胞外类脂分泌等方面，从而参与生物菌膜的形成调控。
借助已有的对沙门氏菌生物菌膜形成的机制研究以及细菌基因组测序技术，预测分析sRNA对沙门氏菌生物菌膜形成过程中转录水平上的调控作用。本实验运用多重序列比对技术识别鉴定sRNAs，并利用RT-qPCR技术验证分析特征性sRNAs的差异性表达。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要试剂 氯化钠、乙醇、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯仿、双缩脲试剂均为分析纯，购于上海化学试剂有限公司；缓冲蛋白胨水（BPW, Buffered peptone water）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB, Trypticace soy broth）均购于北京路桥有限责任公司、RNase-free水、PCR预混液Premix购于宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖购于北京索莱宝科技有限公司。
1．1．2 主要仪器设备 SG403A Sterile GARD生物安全柜，美国BAKER公司；DHG-III电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SPX-250BZ型生化培养箱，上海博讯实业有限医疗设备厂；HVE-50灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；Microfuge@22R台式离心机，美国BECKMAN公司；TGL-16G高速台式离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；MLX-206手掌型离心机，赛伯乐仪器有限公司；WH-2微型旋涡混合仪，上海沪四分析仪器有限公司；Thermal Cycler普通PCR仪，美国Applied Biosystems公司；M2多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；FE20K型pH计，瑞士Mettler Toledo公司；PL202-L天平，瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；SIM-F124制冰机，日本SANYO公司；食品级304不锈钢表面（50×20×1mm, 2B光洁面），东莞中意不锈钢材料有限公司；BagMixer400VW均质机，法国Interscience公司；平底透明96孔酶标板，美国Corning公司
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