蝎毒多肽CTR抗菌及抗肿瘤机制的研究(3)
(A)桶板模型(B)毯式模型(C)环孔模型(D)分子电穿孔模型(E)脂筏模型
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
蝎毒合成多肽CTR；LB液体培养基：酵母提取物10g、胰蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL，pH 7.2，105kPa、121℃高压蒸汽灭菌20min；LB固体培养基：在液体培养基的基础上，加入20g琼脂粉，105kPa、121℃高压蒸汽灭菌20min；RPMI 1640培养基为Gibco公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品；MTT、DMSO、胰蛋白酶、双抗均为Sigma公司产品；2.5%戊二醛溶液：1mL 25%戊二醛、4mL ddH2O、5mL PBS；DNA Ladder试剂盒。
1.1.2 受试细菌及细胞株
四种标准菌株及临床耐药菌共计15株菌株为本实验室提供；SGC细胞株、HEK 239细胞株及Huh7细胞株为本实验室冻存。
1.1.3 主要仪器
计算机软件DNAStar、SignalP4.0；CO2 培养箱；显微镜；超净工作台；高速低温离心机；酶标检测仪；低温冰箱；扫描电镜；96孔板；无菌离心管。
1.2 方法
1.2.1 CTR序列的测定与分析
从已测得的毒素转录组中找到一条抗菌肽序列，命名为CTR（基因的信息链接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/JZ122276.1），通过计算机软件DNAStar、SignalP4.0预测该抗菌肽结构，确定其抑菌活性，并参照相关资料分析其抑菌范围。
1.2.2 CTR溶液的配制
化学合成的CTR为乳白色粉末状固体，称取适量粉末，用无菌水将其配制成5mg/mL的溶液，0.22μm细菌滤膜过滤。倍比稀释，分别得到2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL的CTR溶液，EP管分装，－20℃保存备用。
1.2.3 溶血试验
小鼠摘眼球取血，将血与阿氏液按1：1比例混合置于离心管中。1200rpm离心5min，弃上清，PBS洗涤至上清液不再呈红色为止。将洗涤好的红细胞加适量PBS稀释成107-108个/mL浓度的悬浮液。设置三种药物终浓度：5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL，每个浓度三组重复，每个离心管加入红细胞溶液270μL，CTR溶液30μL，阳性对照以Triton-100替代CTR，阴性对照以PBS替代药物，混合均匀。37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，将上清液转移到96孔板中，于酶联免疫检测仪540nm处测吸光值。
1.2.4 抑菌圈分析
细菌接种于Luria-Bertani（LB）固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用接种环挑取单菌落均匀涂布于LB固体培养基表面，将经过灭菌的直径为0.5 cm的小滤纸片粘贴于培养基表面，取10 μL待测样品（2mg/ml）滴加于滤纸片上。37℃培养箱中倒置培养16 h，观察抑菌圈形成与否，有抑菌圈形成则表示样品有抑菌活性。抑菌圈的大小可以衡量抗菌活性的强弱。
1.2.5 最小抑菌浓度（MIC）测定
将三种细菌分别接种于LB固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用接种环挑取单菌落转接到LB液体培养基中，37℃培养箱震荡培养至对数生长期。在紫外分光光度计上检测菌液OD600，根据1 OD600 = 1×109 CFU/ml将菌液用液体LB培养基稀释至2×105 CFU/ml。在无菌96孔板各孔中预先加入100 μL LB液体培养基，然后在第一孔中加入100 μL稀释到一定浓度的经0.22µm微孔滤膜过滤除菌的抗菌肽样品，混匀后取100 μL 加入第2孔，依次倍比稀释，从第12孔吸出100 μL弃去，至此二倍浓度梯度样品即制备好。向各孔中加入已稀释好的菌液100 μL，混匀后于37℃缓慢震荡培养16 h，测定600 nm处的光吸收值。结果计算：取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔样品浓度之和的平均值作为样品最小抑菌浓度。
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