一株新城疫基因VII型病毒的致病力的研究(2)
1 材料与方法
1．1 材料
种毒：GD/HZ/2015株为基因VII 强毒株，采集于15年广东某鸡场，已有诺倍威公司进行三次纯化。此毒株可以用来建立良好的攻毒模型，评价疫苗的效果。同时，也可以通过反向遗传操作技术，进行基因改造后致弱，构建良好的新型疫苗株。
实验场地：37℃温室，动物房、研发实验室等。
实验仪器：隔离器，-80℃冰柜，超净台，PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪等
实验动物：10日龄SPF鸡胚、21日龄雏鸡均由诺倍威公司提供。
1．2 方法
1.2.1 种毒的扩增
该种毒采集于15年广东某鸡场，已经过三次纯化。取30枚10日龄的鸡胚，每一枚接种新城疫病毒0.1ml于尿囊腔，37℃温室培养，每24小时观察鸡胚存活情况。收集24~72小时存活鸡胚的尿囊液，4℃ 8000g/min离心5分钟，取上清，分装，于-80℃保存。
1.2.2基因VII型序列测定
提取病毒RNA，用RT-PCR技术扩增出病毒的F基因进行进化分析。
1.2.3 鸡胚半数感染量(EID50)测定
用PBS将各病毒尿囊液稀释至10-5，10-6,10-7.10-8,10-9浓度，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，每个稀释度接种10枚。接种后于37℃温室继续孵化，照蛋72h。每24小时照蛋一次，收集死亡鸡胚至4℃冰箱保存。检测鸡胚尿囊液HA活性，用Reed Muench法计算EID50。
1.2.4 攻毒实验
取保存的尿囊液，由106ELD50/ml开始做10倍连续稀释至102，每一稀释度接种10只鸡。接种量0.1ml/只。经滴鼻点眼接种攻毒，分别隔离饲养。攻毒后连续观察14天。详细记录实验鸡的发病、死亡情况，对病死鸡进行剖检，取死鸡的脾脏，作病毒分离、鉴定。计算病毒半数致死量（LD50）。
2 结果与分析
2．1 实验结果
2.1.1 基因VII型序列测定
NDV基因的进化树可见附录1。
对F蛋白进行分子特征分析。F基因见附录2.
2.1.2鸡胚半数感染量(EID50)测定
11月9日
用PBS将种毒稀释至10-5，10-6,10-7.10-8,10-9浓度，接种于10日龄SPF鸡胚，每个浓度10枚，0.1ml/枚。于37℃温室培养
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