兔出血症病毒变异毒株VP60基因特异性噬菌体肽库的构建(2)
2.2 VP60基因随机片段制备.7
2.3 肽库滴度的测定结果8
3 讨论.9
3.1 结果讨论.9
3.2 实验讨论.9
致谢.9
参考文献9
附录11
兔出血症病毒变异毒株VP60基因特异性噬菌体肽库的构建
兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种以急性肝坏死为主要特征的烈性传染病，传染性强，死亡率高[1]。1984年2月在我国首先爆发后[2]，于朝鲜、韩国、意大利、德国、印度等国家相继出现该病的报道，目前于世界各国均有流行。该病在对养兔业造成巨大经济损失的同时还严重威胁着濒临灭绝的野兔品种[1]。被我国列为二类疫病，OIE将其列为B类疫病。
RHDV在之后的30年内不断发生变异，研究者根据系统发育关系，将RHDV毒株分为G1-G6基因组[3]。G.Le-Recule等[4]2010年于法国兔场发现一株非典型兔瘟，命名为RHDV2(RHDVb)。在临床症状上RHDV2与高致病性RHDV相同，以实质器官的出血和淤血为主要特征，但RHDV2的感染相比之下出现了更多的亚急性和慢性感染[4]。RHDV2与经典的G1-G6型RHDV在遗传特性上较大的差异，以往用来免疫RHDV的疫苗对RHDV2的感染不能产生有效的交叉免疫保护作用，导致该毒株在家兔和野兔中以取代经典RHDV之势迅速传播。RHDV2具有传播速度快、潜伏期长、感染宿主的范围较经典毒株更广的特点[5]，比经典RHDV具有更大危害。
RHDV2为杯状病毒科兔病毒属单股正链RNA病毒[6]，病毒颗粒无囊膜，呈正二十面体对称结构，直径32-44nm。Genebank已记录了RHDV2的全序列(登录号：KM878681)，命名为RHDV-N11，基因全长7447bp，5'非编码区9nt，3'非编码区69nt长于经典RHDV和RHDVa。RHDV2基因组包含ORF1和ORF2两个开放阅读框，其中ORF1(10bp-1044bp)编码的大蛋白裂解后产生的蛋白之一为核衣壳蛋白VP60，是RHDV分子主要的结构蛋白[1,7]。
VP60由180个化学上完全相同的亚单位组成，单体分子质量约为60ku，在诱导抗病毒感染的免疫反应中发挥重要作用，是病毒免疫保护性抗原[8]。刘怀然等[9]对不同毒株的VP60基因进行了扩增和测序，将其结果在Genbank进行对比，核苷酸同源性为91%-98%，氨基酸同源性为94%-99%，且氨基酸的变异没有引起VP60蛋白高级结构的变化，这些数据表明了VP60基因具有保守性。VP60凭借其免疫源性和保守性成为了免疫学上诊断RHD的首选蛋白，近年来国内外研究者以VP60蛋白为基础在RHDV检测方面进行了大量研究，并建立了诸多基于VP60的检测技术。
噬菌体展示肽库技术，是一种基因工程重组表达技术，它的原理是将外源序列插入到噬菌体表面蛋白的特异性位点，使插入序列与噬菌体蛋白能共享一个阅读框[10]，最后以嵌合蛋白形式将外源氨基酸展示于噬菌体表面，病毒颗粒也依然保存正常的生理活性。通过构建噬菌体展示肽库，可以获得特异性肽段从而发现其具有的新性能，研究者依据这个特点把它们视为寻找特异性配体比较有效的一种方法。本实验构建的RHDV2 VP60基因特异性噬菌体展示肽库，为筛选VP60抗原表位奠定基础[11]，对阐述RHDV2的感染、致病和免疫保护机制具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 质粒、菌株、噬菌粒及辅助噬菌体
质粒pMD19-T-VP60-2、大肠杆菌XL1-Blue [ F’proAB+，lacIq lacZ△M15，Tn10 (tetr)]、噬菌粒pC89及辅助噬菌体VCSM13均由江苏省农业科学院兽医研究所兔病课题组构建并保存。
1．1．2 主要试剂
Platinum®Pfx高保真DNA 聚合酶(50U/μL)购自Invitrogen公司；DNA Marker DL2000及DL5000、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、DNaseⅠ、CIAP、pEcoRⅠ接头、DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自TaKaRa公司；离心滤器装置Microcon YM10购自Millipore公司；其他试剂均为国产分析纯级。