商品化试剂盒对动物组织RNA提取方法的比较(2)
实时荧光定量 PCR的原理是以荧光共振能量转移原理为基础[11,12]。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct值是实时荧光PCR中一个很关键的因素，C代表循环（Cycle），t 代表阈值（Threshold）。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线[13-15]。因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR 可以利用荧光信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物的变化，可以对初始模板量进行定量分析。简单地说，实时荧光定量PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量[16-18]。
大量的研究实验证明：虽然提取RNA的方法很多，但是其基本都是把细胞破碎以后，以除去材料中糖、蛋白质、DNA等杂质为目标。而且材料自身物理化学性质的不同，不同的材料需要不同的提取方法［19 ,20］。因此，需要通过对比试验，针对不同细胞组织，选择更加合适的RNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 试剂
高致病性猪繁殖于呼吸综合症活疫苗（JXA1-R株，中牧实业股份有限公司），猪瘟耐热保护剂活疫苗（C株，成都天邦生物制品有限公司，），日本乙型脑炎弱毒活疫苗（SA14-14-2株，中牧实业股份有限公司），TRNzol Plus总RNA提取试剂（南京天为生物科技有限公司），动物RNAOUT（北京天恩泽基因科技有限公司），RNAiso Plus（宝生物工程有限公司），柱式病毒RNA-DNA双提试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司），QeasyTM快速DNA/RNA共提试剂盒（上海快灵生物科技有限公司），氯仿（上海申博化工有限公司），乙醇（上海申博化工有限公司），异丙醇（上海申博化工有限公司），逆转录试剂盒（爱必梦生物科技有限公司），Mixture（爱必梦生物科技有限公司）
1.2 总RNA提取
1.2.1 细胞裂解液法提取RNA
(1) RNAiso Plus法
取疫苗稀释液100μL，加dH2O稀释到500μL，加700μL 细胞裂解液；剧烈振荡，静置5-15min，充分反应，期间振荡摇匀；加氯仿200μL，剧烈振荡，静置5min；12000rpm/min，4℃离心5min；吸取600μL上清，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀；-20℃保存30min以上；12000rpm/min离心15min，弃上清；加入400μL，75%的乙醇，颠倒4次；12000rpm/min 离心5min，弃上清；12000rpm/min，瞬离，吸干；吹干；每空加入30-40μL RNase free dH2O，-80℃保存备用。
其中，疫苗稀释液有三种（PRRSV、CSFV和JEV）。每组试验设立三个重复。
（2）RNAOUT法
取疫苗稀释液100μL，加dH2O稀释到500μL，加700μL 细胞裂解液；剧烈振荡，静置5-15min，充分反应，期间振荡摇匀；加氯仿200μL，剧烈振荡，静置5min；12000rpm/min，4℃离心5min；吸取600μL上清，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀；-20℃保存30min以上；12000rpm/min离心15min，弃上清；加入400μL，75%的乙醇，颠倒4次；12000rpm/min 离心5min，弃上清；12000rpm/min，瞬离，吸干；吹干；每空加入30-40μL RNase free dH2O，-80℃保存备用。