辽宁地方鸡禽白血病病毒J亚群gp85基因序列变异分析(2)
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参考文献14
辽宁地方鸡禽白血病病毒J亚群gp85基因序列变异分析
禽白血病(Avian leucosis) 是对养禽业危害较大的疾病之一，由反转录病毒科的禽白血病病毒 (Avian leucosis/sarcoma virus，ALV) 引起。鸡白血病病毒分成A、B、C、D、E和J共6个亚群，其中危害鸡群的主要是A、B和J亚群。ALV-J最初是1991年由Payne等[1]在英国肉种鸡群中分离得到，我国最早是杜岩等[2]1999年从商品肉鸡中分离到ALV-J，其后呈现迅速蔓延趋势[3-6]，几乎在全国所有的省份都有所发现；并且不仅肉鸡、蛋鸡，甚至地方鸡种也广为发现。ALV-J的传播既有水平方式，又可以通过鸡胚进行垂直传播，导致感染鸡群的死亡率升高、生产性能下降。由于ALV-J感染而引起的免疫抑制作用，严重影响禽流感等烈性病的免疫预防效果，因此种群净化和预防成为当务之急。国外虽然已开发出用于检测ALV-J抗体的诊断试剂盒，但价格昂贵、成本高；目前国内还处于研究阶段[7-9]，没有形成市场化诊断产品。关于ALV-J疫苗，免疫佐剂是一个关键因素。有很多研究者尝试添加各种佐剂，如：F佐剂和C佐剂联合重组亚单位疫苗[10]，采用脂质体或二氧化硅纳米粒包被gp85蛋白[11-12]；或采用CpG和白油佐剂YF01作为佐剂，同时添加免疫增强剂—泰山马尾松花粉多糖(Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharide, TPPPS)[13]。综合分析可以看出，ALV-J gp85重组蛋白的佐剂和增强剂提升了抗体滴度，增加了抗体持续时间，提供了更好的免疫保护和母源抗体。
由于ALV-J病毒复制过程中RNA聚合酶缺乏校对功能，因此复制错误率较高而形成遗传上的不稳定性和多样性，导致ALV-J不同分离株之间抗原表位差异很大，差异主要集中在囊膜糖蛋白gp85序列高变区内[14]。gp85是ALV病毒表面的球状结构，能够识别靶细胞膜上的特异性受体，刺激机体产生中和抗体，是ALV亚群分类的主要依据和主要抗原蛋白。ALV-J gp85比其他亚群(A-E)的gp85核酸序列短93-126个碱基。gp85基因具有3个可变区(vrl、vr2、vr3)和2个宿主范围决定簇区(hrl、hr2)，其顺序为vr1-vr2-hrl-hr2-vr3[7]。gp85高变区主要集中在hrl、hr2和vr3这三个区域，其中hrl和hr2区域更是变异集中区域[15]。
辽宁地方鸡—庄河大骨鸡具有抗病力强、体大蛋大、肉鲜美的特点，是我国著名的肉蛋兼用型地方良种，2006年被列入国家级畜禽遗传资源保护品种、被国家工商总局认定为地理商标。虽然一直以来认为该地方鸡具有高抗病力，但从几年的饲养试验中发现，个别鸡只会发生皮肤、肝脏或其它部位的白血病症状，继而引起死亡，因此本实验所选择的大骨鸡养殖场在育种过程中增加了禽白血病病毒的检测，以净化种群，提高种群的健康度和生产性能。本研究以该试验场2016年底-2017年初的F3代母鸡为试验群体，通过禽ALV p27抗原ELISA检测、阳性鸡ALV-J gp85基因扩增、病毒的细胞分离、ALV-J gp85基因测序和与国内其它毒株比较，从宏观上了解该鸡场ALV的感染情况和ALV-J gp85的变异特点，为今后该鸡场的ALV净化和ALV-J gp85的深入研究奠定了一定的基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 试验鸡群和样品采集
试验鸡群为辽宁某地方鸡—庄河大骨鸡试验场，取F3代鸡群的450只母鸡。采集母鸡血清用于ELISA检测试剂盒检测。对ELISA检测阳性鸡屠宰，无菌采集肝脏并液氮保存。
1.1.2主要试剂
鸡胚成纤文细胞DF-1购自上海纪宁实业；胎牛血清（FBS）、DMEM细胞培养基购自GIBCO公司；DMSO购自北京索莱宝公司；琼脂糖、凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司； Marker DL5000、HS 聚合酶、pMD-18T载体试剂盒购自TaKaRa公司；荷兰BioChek禽ALV p27抗原ELISA检测试剂盒购自迪美诺生物公司。