戊二醛癸甲溴铵溶液实验室微生物杀灭效果试验(2)
戊二醛癸甲溴铵溶液实验室微生物杀灭效果试验
由于单一消毒剂的消毒效果往往不太理想，亟需研究复合型消毒剂进行协同作用[1-5]，增强消毒性能。戊二醛是一种具有杀菌谱广、副作用低、性质稳定等诸多优点的消毒剂，被誉为化学消毒剂发展史上的里程碑之一[6]，是国内医疗器械消毒剂的首选[7]。而癸甲溴铵协同戊二醛能顺利进入微生物内部，改变蛋白质的结构和降低酶的活性，增强消毒作用，同时减小戊二醛的气和腐蚀性[8]。戊二醛癸甲溴铵溶液对大肠杆菌[9]、链球菌[10]等细菌的灭菌试验已有相关研究，但对病毒的杀灭效果试验鲜有涉及。本试验探讨戊二醛癸甲溴铵溶液对病毒的杀灭作用，扩大其杀灭微生物的范围，将有助于戊二
醛癸甲溴铵溶液的进一步研究和应用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试产品
对照消毒剂为安灭杀（100ml：15%戊二醛+10%coco专利季铵盐），购自英国考文垂化学药品有限公司。戊二醛癸甲溴铵溶液（100ml: 25g戊二醛+25g癸甲溴铵），批号：20141207，由瑞普（天津）生物药业有限公司提供。
1.1.2 试验毒株
病毒：鸡新城疫病毒（NDV，Losata株）,由江苏省农科院提供，EID50为108.17/0.1ml；猪瘟兔化弱毒(20万个家兔最小感染量)，由江苏省农科院提供，20倍稀释备用；猪细小病毒（NADL-2）,购自中国兽医药品监察所。
1.1.3 试剂及试验动物
FITC-葡萄球菌A蛋白，购自博士德生物工程有限公司；猪细小病毒阳性血清，由瑞普（天津）生物药业有限公司提供；10日龄SPF鸡胚，购自南京乾元皓；PK-15细胞，由本实验保存；1.5-2.0 kg的健康家兔，购自南京圣民科研动物养殖场；中和剂（1%甘氨酸+3%吐温80）、灭菌生理盐水、1%红细胞悬液和0.03M pH7.2的磷酸盐缓冲液，均由本实验室自行配置。
1.1.4 主要仪器
隔水式恒温培养箱、水浴锅、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、移液器、体温计、CO2恒温培养箱、PH测试仪、荧光显微镜、超净工作台等。
1.2 内容及方法
1.2.1 戊二醛癸甲溴铵溶液对鸡新城疫病毒的杀灭效果试验
1.2.1.1 消毒剂对鸡胚的安全性试验
将戊二醛癸甲溴铵溶液分别稀释250倍、500倍、1000倍、2000倍、4000倍，同时设对照药物组（安灭杀），将安灭杀作150倍稀释；每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml,置37℃温箱培养120h,并记录鸡胚的死亡情况，验证各稀释度的消毒剂对鸡胚的毒性作用。
1.2.1.2 中和剂和中和产物对鸡新城疫病毒及鸡胚生长的影响
中和剂选择甘氨酸(1%)+吐温80(3%)溶液，将病毒样液稀释500倍，试验分6组，消毒剂+病毒液、(消毒剂+中和剂)+病毒液、中和剂+病毒液、(消毒剂+病毒液)+中和剂、生理盐水组、病毒对照组。每组接种5枚鸡胚，每胚0.1ml，置37℃温箱培养120h,记录鸡胚死亡情况，并取24h后死亡的鸡胚及活胚尿囊液，进行血凝试验（参照1.2.1.3）。其中，新城疫病毒的EID50为108.17/0.1ml。试验在20℃水浴中进行。
1.2.1.3 血凝试验
（1）96孔V型微量反应板中，每孔加0.025mlPBS。
（2）第一孔加入0.025ml抗原，吹打混匀，吸取0.025ml混合液加入第二孔，吹打混匀，依次进行倍比稀释，至11孔后吸取0.025ml弃掉。
（3）每孔加入0.025ml 1%的鸡红细胞悬液，混匀1min，室温静置10-20min。对照孔（第12孔）的红细胞显著呈纽扣状时，开始判定血凝结果。
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