表达IBDVVP2和鸡C3d基因重组火鸡疱疹病病毒的构建(3)
本试验通过构建哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记表达盒（MCMV – gpt - SV40 polyA）以及目的基因表达盒（MCMV - VP2 - C3d - BGHpolyA）的重组火鸡疱疹病毒转移载体并双酶切鉴定，然后将该转移载体与HVT DNA共转染鸡胚成纤文细胞（CEF）。使用霉酚酸（MPA）阻断其核酸代谢途径，经过加压筛选获得重组火鸡疱疹病毒rHVT - VP2 - C3d并鉴定，为下一步IBD基因工程疫苗的制备奠定基础。
1.材料与方法
1．1材料
1.1.1 主要试剂
质粒pMD19 - gpt、质粒pMD19 - VP2 - C3d，均由江苏省农业科学院兽医所生物兽药实验室保存；pMD19 -T Simple Vector质粒购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α
购自Invitrogen公司；鼠IgG购自武汉博士德公司；MCMV启动子购自南京金斯瑞生物科技公司；Trans2KPlus DNA Marker、质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；连接试剂盒、2×PCR Mix、EcoRⅠ、XhoⅠ、X - gal均购自TaKaRa公司。胶回收试剂盒、限制性核酸内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。DMEM培养基为GIBCO公司产品；小牛血清为浙江天航生物有限公司产品。
1.1.2 SPF鸡胚和病毒
SPF种蛋购自山东育凤农业科技有限公司无特定病原种鸡场，在实验室孵化成11日龄的鸡胚；火鸡疱疹病毒Fc - 126株购自南京天邦生物科技有限公司。
1.1.3 主要仪器设备
纯水仪，双人单面超净工作台，高速台式低温高速离心机，落地式低温高速离心机，二氧化碳恒温培养箱，PCR仪，高速台式离心机，恒温空气浴摇床，旋涡震荡器，电子天平，垂直板电泳系统，滤器，酶标仪，凝胶成像系统，倒置显微镜，倒置荧光显微镜，超声波破碎仪。
1.2重组火鸡疱疹病毒转移载体的构建
1.2.1 重组火鸡疱疹病毒UL45和UL46同源臂的克隆
根据GenBank中已发表的HVT FC - 126的序列，针对其UL45和UL46非必需区分别设计引物，引物R(UL45)和引物F(UL46)有25个碱基反向互补。引物设计分别为：
F(UL45):5 – CGGGGTACCTCAAGTGATACTGCGTGA - 3 (划线部分为Kpn I酶切位点)；R(UL45):5 – AGATCTTCCGTCGACGCGTGAATTCTATTTACTCATCGCATTAGAGAGG - 3(划线部分为Bgl II、Sal I、EcoR I酶切位点)；
F(UL46):5 - GAATTCACGCGTCGACGGAAGATCTAAAACACACCTCTAACGGTTAC - 3 (划线部分EcoR I、Sal I、Bgl II 酶切位点)
R(UL46):5 – CTAGTCTAGAATGGAAGAAATTTCCTCC - 3 (划线部分为Xba I酶切位点)
以HVT FC - 126基因组为模板，通过PCR扩增分别得到UL45和UL46基因。
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