产毒素性多杀性巴氏杆菌感染抗体间接ELISA方法的建立与优化(2)
目前常见的产毒素性多杀性巴氏杆菌血清学检测方法有IHA、琼脂扩散实验以及酶联免疫吸附实验（ELISA）等。琼脂扩散实验和IHA敏感性较低，操作繁琐，所以并不适用于临床上对于大批量血清样品的检测，而大量实验证实间接ELISA方法灵敏性较高[8,9]。此外ELISA准确度高、特异性强[10,11]，特别是近年来酶联免疫检测仪的普及让ELISA应用更为广泛。
间接ELISA可以一次性检测大量样品并且准确性好，因此在临床上，不仅可以使用该方法对产毒素性多杀性巴氏杆菌感染的血清学流行病学进行调查，掌握其分布规律，还可以在疫苗免疫后，对猪群不同时期的血清抗体进行检测，得出抗体的消长规律，并依此制定较为合理的免疫程序，避免出现免疫空白期。
PAR是影响养猪业的重大传染病之一，由于我国的养猪业不断趋于集约化，其在我国的发病率也呈上升趋势，对养殖公司和养殖户造成了严重的经济损失。因此，为了更好的对预防、控制该病，研究客观、准确、操作简便的检测方法势在必行[6]。
1 材料与方法
1.1 材料
由本实验室构建、保存该原核表达质粒pCold I-toxA；宿主菌为E. coli Rosetta菌株，阴阳性血清从临床血清中筛选，经Western blot检测证实；其他化学试剂为国产或进口分析纯。
1.2 抗原蛋白的制备
1.2.1 重组质粒pCold I-toxA的转化与重组菌的诱导表达
将本实验室已构建好的重组质粒pCold I-toxA转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，在超净台中用移液器于含0.5mg Amp的3mL LB中接种30µL菌液，37℃、200r/min振荡培养过夜。在超净台中用移液器于含0.5mg Amp的3mL LB中接种30µL菌液，37℃、200r/min振荡培养至其OD600为0.6-0.8时（对数生长中期），加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导表达，在18℃诱导表达24h后收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，染色分析重组蛋白表达情况。
1.2.2 SDS-PAGE 电泳分析
取收集的菌液，离心吹打重悬沉淀，重复一次，用5×Loading Buffer按比例稀释混匀后于水浴锅100℃水浴8min，取上清加样进行 SDS-PAGE电泳分析。
1.2.3 重组蛋白的大量表达及纯化
按1.2.1的蛋白诱导表达条件诱导表达重组菌200mL，离心后收集菌体沉淀，按照His-标记蛋白纯化柱的说明书进行蛋白的纯化。
1.2.3 SDS-PAGE 电泳分析
应用纯化的蛋白做 SDS-PAGE 电泳分析。
1.3 间接ELISA条件优化
1.3.1 间接ELISA主要操作步骤
将纯化重组ToxA蛋白用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后加入酶标板，37℃包被2h。用PBST洗涤三次后拍干，每孔加入200µL的含5%脱脂乳的PBST，37℃封闭2h。用PBST洗涤三次后拍干，每孔加入100µL的PBST及大肠杆菌裂解液稀释的待检血清，37℃作用1h。用PBST洗涤三次后拍干，每孔加入100µL的PBST稀释的酶标抗体SPA，37℃作用1h。用PBST洗涤三次后拍干，于暗室中每孔加入100µL的TMB底物溶液，37℃避光显色5min。每孔加入50µL的2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪检测读取各孔OD450nm值，记录分析实验数据。本试验使用的计算公式为：P/N=阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值，选择P/N比值最大的那一组作为本试验筛选出的最佳条件。
1.3.2 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
按方阵滴定法，将按1.2.2中的条件纯化好的PMT蛋白分别用碳酸盐缓冲液（现用现配）稀释至终浓度为0.25、0.5、1、2µg/mL，37℃2h包被ELISA板。PBST洗3次，每次5min。用含5%脱脂乳的PBST，37℃封闭2h，洗涤同上。加入PBST和大肠杆菌裂解液按照1：25、1：50、1：100、1：200、1：400、1：800比例稀释的经Western blot检测证实的标准阴、阳性血清，按照1步骤进行间接ELISA检测，每个条件做一组平行实验，取其平均值，计算各组P/N值，选择最佳包被浓度和血清稀释度。
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