猪圆环病毒2型3E5单克隆抗体的制备与鉴定(2)
目前，PCV2感染已经遍布全球各个养猪的国家，给世界养猪业带来了巨大的经济损失，因此迫切需要建立高效、灵敏的检测方法来控制该病。单克隆抗体是由一个B细胞增殖分化产生的一个子代细胞（浆细胞），针对单一抗原决定簇的抗体[4]。它具有针对特定的单一抗原表位（特异性）、靶抗原多样性、抗体结构多样性、定向性、可以大规模生产等特点，它的很多特点使之成为研究许多病原的有效工具。同时它也被应用到许多领域，如检验医学诊断试剂，蛋白质的提纯，肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术等。最早在PCV2的检测中利用单克隆抗体技术的是McNeilly等科学家，他们使用的免疫原是纯化的PCV2全病毒，通过间接免疫荧光方法，筛选出了针对PCV2 Cap蛋白的单抗[8]。后来，科学家们不断地改进优化单克隆技术，研究者又相继利用原核表达PCV2Cap蛋白[9~12]、纯化PCV2病毒粒子[13~14]真核表达的Cap蛋白等[15~16]为免疫原，进一步筛选出针对PCV2 Cap蛋白的特异性单克隆抗体。并利用特异的单克隆抗体，进行PCV2 Cap蛋白抗原表位分析、PCV2抗原或抗体检测试剂盒等方面的研究[17]。这些研究都为猪圆环病毒的鉴定诊断以及疫苗的研发奠定了一定的基础。
本研究旨在利用已经制备好的杂交瘤细胞进行体外培养，制备腹水，对收集的腹水抗体和杂交瘤上清进行鉴定，并采用多种方法来检测该单克隆细胞株的活力，为今后该病的特异性鉴别诊断奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 细胞、毒株、实验动物及试剂
3E5杂交瘤细胞、PK-15细胞、PCV2毒株，PCV2猪阴性血清由南京农业大学预防传染病实验室制备。6-8周龄经产Balb/c小鼠均购于南京青龙山实验动物中心。RPMI1640和DMEM培养基均购于GIBCO生物公司。新生胎牛血清购于内蒙古复蒙基因生物工程研究开发有限公司。羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgG-FIFC和ProteinA-FIFC抗体购于博士德生物工程公司。蛋白Marker等蛋白生化试剂购自大连宝生物工程有限公司。其他常规试剂为国产或进口分析纯。
1.2 杂交瘤细胞复苏
准备好38-42℃的热水、玻璃棒、温度计、T25细胞瓶。从液氮罐中将杂交瘤细胞3E5取出，迅速放入热水中，快速地搅拌约1~2分钟使其急速融化；1000 rpm离心10 min；在超净台中，将冻存管中的上清弃去，保留下部白色沉淀部分；用含20%胎牛血清的1640营养液将细胞轻轻吹打悬起，转移到T25细胞瓶中，补加5~8 mL营养液；混合均匀后，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后观察细胞状态，若营养液中漂浮的细胞较多时，更换营养液。待细胞长到80%左右时，传代。
1.3 杂交瘤细胞传代
准备弯头吸管、细胞瓶、营养液。待细胞长到80%左右时，倾倒原本的营养液；加入2~4 ml新的营养液；用弯头吸管吸取少量营养液，将细胞轻轻吹下；吹打混合均匀，吸出1/2的混合液至另一新的细胞瓶中；分别补加营养液至；混合均匀后静置培养。
1.4 杂交瘤细胞冻存
按照1640培养基：胎牛血清：DMSO为5:4:1的比例，配制冻存液，取处于对数期后期至稳定期、状态良好的杂交瘤细胞，前期步骤和传代相同，细胞吹打下来后，1000 rpm离心10 min，弃掉上清液，用冻存液将细胞吹打均匀，计数后转入冻存管，然后置4℃ 30-40 min，-20℃1-2 h，-70℃过夜（12 h），快速移至液氮中长期冻存。
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