局部封闭敷贴法TA的皮肤致敏试验研究(4)
（2）树突状细胞浸没试验
郎格罕细胞（LC）是皮肤中主要的抗原呈递细胞，在皮肤变态反应中起着关键作用。有图原代培养的LC难以分离，现在多采用细胞系，或原代培养的外周血来源或骨髓来源的树突状细胞作为替代品。如XS52细胞系是一种来源于新生BALB/c小鼠表皮的细胞，表现出新分离LC细胞许多形态学、表型的和功能特征。骨髓细胞来源的DC细胞系可用于区分致敏物与非致敏物，现有三种细胞系可用，分别是MUTZ-3、U937和IHP-1，其中MUTZ-3与体内细胞特性最接近。细胞培养物暴露于不同浓度的受试化学物，通过碘化丙啶（PI）的方法测定相对细胞活性（rCV）进而确定受试物的浓度。检测终点为CD86和IL-8。目前该方法在sens-it-iv框架内完成实验室间的标准化，正处于大规模的化学致敏剂和刺激测试阶段。
（3）人角质细胞系NCTC2544试验
表皮中超过90%的细胞是角质细胞(KC)，渗入角质层的化学物质首先接触的细胞是就KC。KC 在免疫介导的皮肤疾病中(包括ACD)扮演了重要角色。将体外培养的角质细胞系NCTC25暴露于3个浓度的化学物，通过MTT法检测细胞相对活性(rcV)和检测细胞产生的IL一8筛查受试物的致敏性，如果细胞内IL一8产生超过2倍可判断为阳性[3]。
（4）树突细胞迁移试验
LC经抗原激活后,从皮肤移行人局部引流淋巴结，根据这一原理，可在体外模拟这一过程，用于确区分致敏剂和非致敏剂。采用双室系统,由多孔膜隔开,上层细胞系采用MUTZ一3来源的LC,下层部分含有成纤文细胞或重组趋化因子(CXC1L2或CCLS)。经荧光标记的MUTZ一 LC细胞暴露于接触致敏原后,LC细胞向CXC1L2迁移，而暴露于刺激物导致细胞向CCLS迁移，培养时间为16h。检测终点是下部MUZT一LC细胞数量(由荧光素测定)。如果CXLI12 / CCL 5>1.0，则判定为致敏感物，如果CCLZ12/CCL5<1.0，则为非致敏物。
（5）QSAR模型
化学物的生物学特性与其固有的化学结构密切相关，采用定量结构活性关系(QSAR)研究化学物致敏性方面取得了很大进展[3]。此类模型可作为预测化学物致敏性的起始工具，用于快速筛选可能具有致敏性的物质。例如计算机专家系统DEREK,重点研究化学物是否含有能与膜蛋白结合的结构。使用时，采用人机对话的方式，通过两步策略预测化合物的皮肤致敏性，首先通过预先设定的规则库分析化学物质是否具有与皮肤蛋白发生反应的能力，或者是化合物的直接作用或者是通过代谢后起作用。如果无触发结构警示，说明化学物不具有发生化学反应的结构特点，这些化学物无需再进行下一步计算机评估。 第二步应评估其皮肤渗透性或分配参数，可采用经验值、计算或预测辛醇 /水分配系数(logP）。
1.3.3 体内试验
预测皮肤致敏性最常选用的动物是豚鼠。在以往的数十年间两种类型的试验得到了发展：一种是加佐剂的方法，敏化作用通过注射福氏完全佐剂（FCA）得到加强。另一种是不用佐剂的方法。在OECD化学品测试准则中，曾经收录过4个加佐剂和3个不加佐剂的方法。在目前依然有效的1992年采用的OECD 406准则中将加佐剂的Magnusson和Kligman的豚鼠最大反应试验（GPMT）和不加佐剂的Buehler试验（BT，局部封闭敷贴的方法）作为优于其他的方法进行了重点推荐。
（1）豚鼠最大反应试验（Guinea Pig Maximization Test，GPMT）
豚鼠最大反应试验是国际上确定的评价化学物质皮肤致敏作用的经典方法之一。此方法使用福氏完全佐剂作为免疫增强剂，试验包括皮内注射、皮肤涂抹诱导和皮肤接触激发三个过程。试验组至少10只豚鼠，对照组至少5只。如果试验结果难以确定受试物的致敏性，应增加动物数，试验组20只，对照组10只。诱导受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度, 激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。第0天( 诱导接触)，将受试物皮内注射入豚鼠颈背部皮下, 第7天 ( 诱导接触) 将涂有受试物的滤纸贴敷在同一注射部位去毛区固定48 h。2周后，第21天( 激发接触)，再将涂有受试物的滤纸贴敷在豚鼠躯干部去毛区固定24 h。激发接触后，除去受试物滤纸后24 h、48 h 和72 h观察和记录试验组与对照组动物的皮肤反应，进行致敏强度分级。