大肠杆菌O26的分离与鉴定(2)
目前关于产志贺毒素大肠杆菌O26的研究越来越多，关于它的分离和检测方法也是报道不少，但是国内的研究依然不多。本实验从这种大肠杆菌的取样分离讲起，并尝试了多种适用于它的鉴定方法，希望能为以后再这方面的研究和工作提供一个思路。目前常用的检测方法有平板培养法、凝集试验、酶联免疫吸附试验、免疫磁珠分离技术、蛋白质芯片检测法、聚合酶链反应、脉冲场凝胶电泳、基因芯片等等。在这些已经应用到实验的检测方法中，聚合酶链式反应的方法虽然具有快速、特异性高、灵敏等特点，但需要技术人员的多次重复实验[10]。免疫学的相关检测方法比如酶联免疫吸附实验、免疫磁珠分离技术等在在实际实验的操作使用中不仅有着灵敏快速的使用特点，而且还能做成便于携带便于系统操作的试剂盒，应用方法简单，适用范围也很广[10]。免疫学方法中的免疫磁珠分离技术可以大量缩短实验时间，所以常应用于酶联免疫吸附实验和胶体金免疫层析技术中[10]。所以在本次实验中，我们选择了平板培养法来进行可疑菌株的分离，在基因的初筛中选择了PCR技术和凝胶电泳实验，在鉴定步骤中选择了血清凝集试验和生化试剂盒鉴定，最后选择了药敏试验来确定其对不同药物的敏感性。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品来源
江苏省某肉牛屠宰所，屠宰加工环节胴体擦拭样品。
1．1．2 主要仪器与试剂
EC肉汤培养基、显色平板均自行配制；DNA Marker、质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；生化试剂盒购自北京陆桥技术有限责任公司；血清型检验试剂盒购自宁波天润生物技术有限公司。
纯水仪，双人单面超净工作台，高速台式低温高速离心机，落地式低温高速离心机，二氧化碳恒温培养箱，PCR仪，高速台式离心机，恒温空气浴摇床，旋涡震荡器，电子天平，垂直板电泳系统，滤器，酶标仪，凝胶成像系统。
1．2 方法
1．2．1 样品采集和増菌
首先将样品接种EC肉汤，41 ℃増菌6h。取増菌培养物1ml，10倍比稀释涂布选择性显色培养板，37 ℃培养10h。次日，挑取可疑菌落接种梅花板保存菌株，待进一步鉴定。
1．2．2 PCR和凝胶电泳分析
（1）基因扩增
选用实验室保存的O26引物，O26 F: 5' TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA 3'和O26 R: 5' TAATAATTTTCTCTGC CGTCGCG 3，扩增026片段。反应体系：25µl的2×Mix，0.5µl的上下游引物，3µl的DNA，补水至50µl。阳性扩增片段，切胶回收。
（2）目的基因回收和克隆
将上述扩增阳性片段，切胶回收，步骤如下：在紫外灯照射下确定目的条带的位置，尽量准确地用手术刀切下目的基因对应的琼脂糖凝胶条带，提高基因回收效率。将凝胶块装入已知重量的EP管中，大约为100µl。向装有凝胶的EP管中加入600µl的buffer DE-A， 75℃融化凝胶，然后再加入1/2体积的buffer DE-B，颠倒混匀，而后再加入200ul的异丙醇。颠倒混匀。将混合溶液加入离心柱中，12000r/min，离心1min，弃流出液。再加入700µL Buffer W，12000r/min，室温离心30s，弃流出液。重复一次上一步操作，弃掉离心液后，装回柱子，12000rpm/min，空离1min，除去柱内残留的WB。将柱子放入新的EP管中，在Spin Column的膜中央加入50µL的Elution Buffer，37℃温箱放置2min后，12000r/min离心1min洗脱回收DNA。
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