牛Mx1蛋白抑制猪瘟病毒增殖的初步研究 (2)
Mx蛋白（Myxovirus resistance）是由I型（α/β）和III型（λ）干扰素（Interferon, IFN）诱导宿主细胞产生先天性免疫的关键性抗病毒蛋白之一。50年前，Jean Lindenmann与Alick Isaacs在研究IFN时发现近交系小鼠（A2G）对致命剂量的流感病毒具有天然抵抗力，这正是由16号染色体上的Mx基因控制的[7]。Mx基因几乎存在于所有脊椎动物的基因组中，从鱼到灵长类，它们主要在抑制RNA病毒中发挥作用[8]。，比如：甲型流感病毒（Influenza A Virus, IAV）、水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus, VSV）、索戈托病毒（Thogoto Virus, THOV）等等。近期研究表明人MxA对非洲猪瘟、乙型肝炎等DNA病毒也有抑制作用。Mx蛋白结构在脊椎动物中是高度保守的，大部分的哺乳动物有两个Mx基因，如人有Mx1（MxA）和Mx2（MxB）。不同种属的Mx基因来源于两个不同的复制子，而少部分脊椎动物丢了某一个原始的Mx基因。
Mx蛋白属于发动蛋白家族，具有很强的GTP酶活以及自装配倾向。有N端GTP酶活区（GTPase domain, GD）、中间域（Middle domain, MD）、C端酶活效应区（GTPase effector domain, GED）[14]，但是缺乏PH结构域（参与膜定位）和一个富含脯氨酸的结构域（涉及到蛋白质之间的相互作用）[15]。在低蛋白浓度核磷酸盐浓度下，Mx蛋白在溶液中形成四聚物。在高蛋白浓度（1.5 mg/ml），这些四聚体低聚化形成较大的丝状和环状。
已有研究表明poMx1（porcine Mx1）可以抑制CSFV和VSV的增殖[12]，另有文献报道boMx1（bovine Mx1）抑制VSV，狂犬病毒[15]（Rabies Virus，RV）和口蹄疫病毒[9]（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）的增殖，但是具体是在病毒增殖哪一步产生的抑制作用还有待研究[10]。由于BVDV和CSFV属于同种同属的病毒，并且其抗体具有交叉保护作用，所以研究boMx1抑制CSFV增殖具有一定的理论基础[16]。
本文通过Western blot、实时荧光定量PCR、病毒产量减少试验来探究boMx1蛋白对CSFV的增殖是否有抑制作用。通过本实验补充了boMx1的抗病毒图谱和增加了抑制CSFV增殖的研究。
1. 实验材料
1．1细胞株与病毒
大肠杆菌DH5α、CSFV石门株、真核表达质粒pcDNA3.0、猪肾细胞PK-15均由本实验室保存。
1．2主要试剂
预染蛋白质分子量标准（Thermo scientific，立陶宛）
PVDF膜（PALL，美国）
脱脂奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，中国）
Mx1单克隆抗体（ab79609，abcam）、WH303鼠源单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体（AF0006，Beyotime）、Npro兔源多克隆抗体（由哈尔滨兽医研究所仇华吉老师赠与）、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP
增强型ECL化学发光检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，中国）
Trizol Reagent、 PrimeScript® RT Marster Mix (Perfect Real Time) 、SYBR® Premix Ex Taq™ II（大连宝生物生物科技有限公司（TaKaRa），中国）
去内毒素质粒抽提试剂盒（Omega，美国）
Lip3000转染试剂（Life Technology，美国）
DMEM、1640、胎牛血清（GIBCO，美国）
其他试剂均为进口或国产分析纯
1．3主要仪器
ZDX-35BI型自动电热压力蒸汽高压锅，上海申安医疗器械厂，中国
恒温循环水浴锅，重庆科学仪器厂，中国
倒置显微镜、荧光显微镜（Zeiss，德国）
二氧化碳培养箱（Thermo Scientific，美国）
超低温冰箱（SANYO，日本）
垂直电泳系统，湿转印仪（Bio-Rad，美国）
隔水式恒温培养箱（上海索谱仪器有限公司，中国）
生物安全柜（苏州安泰仪器，中国）
实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）
全自动化学发光成像分析系统，凝胶成像系统（Tanon，中国）
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