SHSY5Y细胞分化后Eph的表达变化(2)
2 实验部分
2.1 主要仪器和试剂
实验仪器：高压锅、玻璃匀浆器、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
实验试剂：SDS-PAGE凝胶、10％过硫酸铵、SDS-PAGE电泳液、转膜液、DAB混合液、洗涤液、封闭液、一抗和二抗稀释液、β-actin、山羊抗兔lgG吹冰根酶（二抗）、一抗（Ephrin-A3）、蛋白Marker、蛋白。
2.2 实验步骤
1. 前期工作的准备：将移液枪枪头进行高压灭菌；玻璃板洗净放入烘箱烘干；配制电泳液：Glycine（甘氨酸）94g、Tris粉末15.1g、SDS5.0g，用蒸馏水定容至1L；配制转膜液：Glycine14.42g、Tris粉末3.03g、甲醇150ml，用蒸馏水定容至1L后放进冰箱冷藏；无菌操作台用75％医用酒精浸泡过的棉球擦拭。
2. 配制下层胶与上层胶
下层胶 上层胶
10%胶 10ml 5% 胶 3ml
蒸馏水 4.1ml 蒸馏水 1.75ml
30%Acr-Bis(29:1) 3.3ml 30%Acr-Bis(29:1) 0.5ml
下层缓冲液（4X） 2.5ml 上层胶缓冲液（4X）0.75ml
10% 过硫酸铵 0.1ml 10% 过硫酸铵 0.03ml
TEMED 0.004ml TEMED 0.003ml
3.SDS—PAGE电泳
（1）灌胶与上样
1、两块玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。
2、按前面方法配制的下层胶，摇匀后即可灌胶。灌胶时， 用移液枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到玻璃板2/3的高度时即可。然后在胶上加一层蒸馏水，进行液封。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，再等3min使胶充分凝固 后倒去胶上层水并用滤纸将水吸干。