年产200吨生物素中间体二酯的合成工艺以及生产车间设计(6)
每个样品做2个平行对照。
3.2.2优化培养条件
金属离子优化：在基本培养基基础上按1g/l的量分别添加金属离子:MgSO4•7H2O; 无水CaCl2; MnSO4•H2O; ZnSO4•7H2O; FeSO4•7H2O; KCl; Na2HPO4•12H2O; NaH2PO4•2H2O。
离子浓度优化：在确定最优添加金属离子的基础上，分别添加不同浓度的离子溶液（ g/L）：0.1,0.3,0.5,1.0,1.5,2.0。
3.2.3细胞干重的测定：
取发酵液100mL在10000rpm下离心5min，弃上层清液。用生理盐水(0.80%)洗涤离心两次，置于60℃烘箱中烘干至恒重。
图3.1 细胞干重标准曲线
以测得的菌体干重计算出菌体浓度（dry cell weight g/L, DCW）。将同样的发酵液稀释不同倍数，并测定在600nm波长处的吸光度（OD600），并以OD600与对应的菌体浓度作图，由实验结果可知，吸光值与DCW具有良好的线性关系，y=0.3876x，R2=0.9993。
3.2.4 OD值的测定方法：
取1ml发酵液，离心(4 oC, 7000 rpm, 5 min)，弃上清液，以0.80% NaCl溶液洗涤同样条件离心1次，以同样的NaCl溶液为空白，将同样的发酵液稀释不同倍数，测定在600 nm波长处的吸光度(OD600)。
3.2.5酶活测定方法：
测定每次发酵液OD值，并根据OD-DCW公式（y=0.3876x，R2=0.9993），取一定量发酵液使最终干细胞重为4mg, 离心(4 oC, 8000 rpm, 5 min)弃上清液，并以0.80% NaCl溶液洗涤离心(4 oC, 6000 rpm, 5 min)2次。所得菌体以950 μL 磷酸盐缓冲液(0.2 M, pH 8.0)重新悬浮，加入50 μL二酸二酯/DMSO溶液，使反应体系中二酸二酯/DMSO溶液最终浓度为10 mM，涡旋振荡，反应条件为180 rpm, 30 oC, 30 min。反应结束用涡旋振荡后取300μL，加入600μL甲醇中，混匀后离心(常温, 8000 rpm，5 min)一个酶活单位(U)定义为：30 oC下，每min催化生成1 mol单甲酯所需要的酶量。
HPLC条件：流动相：甲醇/水：65：35；流速：1.0ml/min；波长：210nm C18柱；流速1.0ml/min；检测器波长：210nm；进液量为20ul；柱温为25℃。
3.2.6单甲酯标准曲线的绘制
为了用高效液相色谱对反应过程进行跟踪及定量检测，有必要建立酶催化产物光学活性单甲酯的标准曲线。本实验选择了0～3.5mol/L范围内的八个浓度，以峰面积-浓度绘制出标准曲线，如下所示；后续实验取样检测反应进程样品的浓度均由峰面积对应标准曲线来得到。
图3.2单甲酯标准曲线4试验结果
4.1标准曲线绘制
各个标样的出峰时间均在7.1min左右。
图4.1标准曲线
确定公式为：y=4.31961 × 10-8x
4.2离子种类的优化：
在基本培养基基础上按1g/l的量分别添加金属离子:MgSO4•7H2O; 无水CaCl2; MnSO4•H2O; ZnSO4•7H2O; FeSO4•7H2O; KCl; Na2HPO4•12H2O; NaH2PO4•2H2O，结果见如下表4.1。
表4.1离子种类对微杆菌细胞产酶的影响
金属离子种类 OD值 总酶活(U/L) 比酶活(U/g) final pH
空白1 7.41±0.02 13.33±2.66 4.64±0.92 5.85±0.01
硫酸镁 11.62±0.26 27.05±8.29 5.97±1.71 5.69±0.01
无水氯化钙 8.66±0.02 11.01±1.97 3.28±0.60 5.80±0.00
硫酸锰 0.85±0.01 2.08±0.27 6.31±0.89 6.59±0.03
硫酸锌 3.13±0.02 9.94±1.43 8.18±1.12 6.73±0.01