大肠杆菌细胞周质分子伴侣的克隆与表达(2)
目前，促进大肠杆菌中异源蛋白折叠的分子伴侣系统分为胞内系统和细胞间质系统，细胞间质系统的分子伴侣系统和胞内系统有明显不同，主要是用于蛋白二硫键的正确形成。由于大肠杆菌周质空间具有独特优势,多数重组蛋白选择在大肠杆菌周质空间表达[8]。实验表明在周质空间进行表达时,与周质空间的热激分子伴侣 Skp、FkpA 等进行共表达可以提高一些蛋白的可溶性表达水平。Ow 等将分子伴侣 Skp 和 FkpA 与重组人源单链可变区抗体(ScFv antibody) 进行共表达时可以提高其可溶性水平[9]。共表达周质空间分子伴侣FkpA也可以达到提高单链T细胞受体在周质空间中可溶性表达水平[10]。细胞周质分子伴侣中，折叠酶可以帮助蛋白质折叠，这类酶催化与蛋白质折叠直接有关的、对形成功能构象所必需的共价键变化。由脯氨酸残基连接的肽键有顺式和反式两种，在天然蛋白质中，该肽键为反式结构。蛋白质在折叠过程中，需要将顺式异构化为反式，这也是蛋白折叠中的一个限速步骤，由肽基脯氨酸顺反异构酶（peptidyl-prolylcis,trans isomerase，PPIase）来催化。一般认为，大肠杆菌肽基脯氨酸顺反异构酶在蛋白折叠起始中起重要作用[11]。但目前以此种分子伴侣，构建外源蛋白原核表达系统的实验还较少，前景广阔，所以大有可为。SurA 存在于间周质，是周质腔肽基脯氨酸顺反异构酶。SurA 包含信号肽后面的 4个结构域：具有前 150 个氨基酸的氨基末端结构域，每个约 100 个残基的两个肽基脯氨酰异构酶（PPIase）结构域和羧基末端结构域。晶体结构显示 N 和 C-末端（NCt）结构域和第一 PPIase 结构域构成核心模块，而第二 PPI 酶区段形成卫星域。SurA 突变导致不能形成正确的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)[12]，造成外膜渗漏，因而使菌体对去污剂及疏水性药物很敏感。SurA 和 OMPs 之间的相互作用机制已经成为许多研究的主题。DegP 是周质腔肽基脯氨酸顺反异构酶，作为质量控制因子受到相当大的关注，其作用机制是通过其双重蛋白水解和伴侣活性，保护细胞免受蛋白质折叠应激。温度变化最初被认为可导致 DegP 两种活性之间的转换，其伴侣活性主导于 28℃，蛋白酶活性在42℃时占优势。已经鉴定出几种可以激活 DegP 蛋白酶活性的体内底物，它们是未折叠的和错位的蛋白质，或者是在过度产生时发生不正确折叠的蛋白质。作为蛋白酶，DegP 被认为可降解周质中不可逆错误折叠的蛋白质，从而减少细胞内应力下的胞质胞内的损伤。尽管大量证据表明 DegP 具有蛋白酶活性，但其伴侣活动的生理作用不太清楚[13]。
FkpA 属于大肠杆菌 FKBP 家族蛋白，是周质腔肽基脯氨酸顺反异构酶的一种。它有两种功能，分别为顺反异构和分子伴侣功能。确切的讲，FkpA 能与早期折叠中间体结合并阻止它的聚合， 因此能有效地促进目的蛋白的可溶表达。FkpA 编码 FKBP 成员，FkpA 缺失刺激 DegP 座位(编码热休克诱导的间周质蛋白酶)的转录。 因为 DegP 的转录受多种胞外压力调节，FkpA可能在间周质或 OMP 折叠方面有功能，当 FkpA 突变失活时将造成胞外蛋白质折叠受损，产生错误蛋白，而使得对 DegP 蛋白酶的需求增加，从而启动 DegP 的转录发生[14]。RotA也是周质腔肽基脯氨酸顺反异构酶的一种，是亲环蛋白类似物，RotA缺失造成 OMP 定位及组装缺陷。目前尚不明确 RotA 具体功效，可能是配合其他分子伴侣联合作用。基于以上两点，本课题选取四种大肠杆菌分子伴侣SurA、FkpA、RotA 和 DegP，通过设计引物，采取 PCR 方法对这四种分子伴侣基因进行克隆，再构建相应表达载体，使这四种分子伴侣蛋白得到表达。通过对这三种分子伴侣的初步研究，为后续研究分子伴侣促进蛋白的可溶性表达打下良好基础。
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