试验性穿透性犬角膜移植(2)
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物实验动物来源于兽医院供血犬，共 4 条成年健康比格犬，体重均在 10.0Kg 左右，公母都有，依次编为 1-4 号。常规单笼饲养，喂食商品颗粒狗粮。每日进行临床检查，7 天后无异样取眼睑组织进行基因序列同源性分析。通过基因序列同源性比对，选取基因序列同源性最高的 2 条犬，临床检查无异样后即进行穿透性角膜移植。1.1.2 设备与器材1.1.2.1 设备血常规分析仪（产地：德国；型号：Abacus junior vet 5）、生化分析仪（产地：中国；型号：AmiShield VCA-TC-100）、手术放大镜、裂隙灯显微镜、检眼镜、眼压计（产地：芬兰；型号：iCare TV01）。
1.1.2.2 器材巾钳、开睑器、手术剪、止血钳、有齿镊、2ml 注射器、5 号斜角冲洗针头、磨砂口小玻璃瓶、角膜环钻、角膜剪、角膜镊、持针钳、6 号羊肠线、4号丝线、铲形针、纱布等。
1.1.3 实验试剂OMEGA组织 DNA 提取试剂盒、OMEGA 胶回收试剂盒。按He Yong-Wen[10]等报道的PCR扩增引物： HLA-F 5’-CCCCACAGCAGTTTCTTG-3’;HLA-R 5’-CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3’。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.1.4 药物阿托品、陆眠宁Ⅱ、苏醒灵Ⅱ、1%硝酸毛果芸香碱、甘露醇、饱和硫酸庆大霉素、粘弹剂、生理盐水、阿莫西林、头孢噻呋、阿米卡星、地塞米松、利巴韦林、0.5%利多卡因、复合溶葡萄球菌酶洗眼液。
1.2 方法1.2.1 DLA-DRB1 基因序列同源性分析
1.2.1.1 眼睑组织采集实验犬左眼滴加1mL0.5%利多卡因， 用手术剪剪取约 20mg 上眼睑组织置于 1mLEP管内，迅速冷冻于-25℃冰箱保存。1.2.1.2 眼睑组织 DNA抽提按照 OMEGA公司的组织DNA 提取试剂盒说明书进行：(1)将样品置于无菌微型离心管中，用提供的10nM Tris-HCL、PBS 或 Elution Buffer将总体积加到 250μL；(2)加入 10μL OB Protease 和 250μL Buffer BL。加 4μL Linear Acrylamide 到 250μLBuffer BL 中。以最大速度涡旋 15s 以彻底混合；(3)65℃孵育 10min，孵育过程中短时间涡旋；(4)加入 260μL 无水乙醇（室温，96-100%）以溶解产物，以最大速度涡旋 20s以彻底混合，再短时间离心；(5)将步骤 4 的产物过柱到2mL 收集管中，8000 xg，离心 1min，弃收集管和废液；(6)将柱子放到新的 2mL 收集管中， 用 500μL Buffer HB 洗柱子， 8000 xg， 离心 1min，再次弃废液，保留收集管；(7)将柱子放到步骤 6 的 2mL 收集管中，加入 700μL DNAWash Buffer（用无水乙醇稀释过），8000 xg，离心 1min，弃收集管和废液；(8)重复步骤 7，保留收集管；(9)将柱子放到步骤 8的2mL 收集管中，最大转速离心 2min 甩干柱子；(10)将柱子置于 1.5mL EP 管中，加入 50-100μL 65℃预热的 Elution Buffer，室温放置 5min；(11)8000 xg， 离心1min以洗脱DNA， 保留含有DNA的液体。 将柱子放到新的1.5mLEP 管中，重复步骤 10-11，弃掉柱子，将洗脱的 DNA -20℃保存。
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