基于氧化石墨烯的荧光发夹探针检测多聚核苷酸激酶
毕业论文关键词：氧化石墨烯；多聚核苷酸激酶；Lambda核酸外切酶
A Fluorescent Hairpin Probe for Assay of Polynucleotide Kinase Activity Based on Graphene Oxide
Abstract: Phosphorylation of DNA with 5'-hydroxyl termini plays a critical role in a majority of normal cellular events, including DNA recombination, DNA replication, and repair of DNA during strand interruption. Because of the importance of polynucleotide kinase in regulating DNA metabolism, the detection of polynucleotide kinase activity and its inhibition has been developed rapidly. In this paper, we construct a novel fluorescent biosensor for the detection of polynucleotide kinase activity. This assay is based on the principle that graphene oxide (GO) shows different binding affinity for different DNA structures and it can also serve as a universal quencher for lots of fluorophores. The proposed method not only provides a sensing platform for polynucleotide kinase activity and its inhibition but also holds a great prospect in the application of biological process study, drug discovery and clinical diagnostics.
Keywords: Graphene Oxide (GO); Polynucleotide kinase (PNK); Lambda exonuclease (λ exo)
目 录
摘 要 1
引 言 1
1 实验部分 3
1.1 仪器与试剂 3
1.2 实验方法 4
2 结果与讨论 4
2.1 实验原理与探针设计 4
2.2 实验原理验证 5
2.3 实验条件考察 6
2.4 传感器的检测性能 7
2.5 传感器的选择性考察 7
3 结 论 8
参考文献 8
致 谢 11
基于氧化石墨烯的荧光发夹探针检测多聚核苷酸激酶引 言
DNA 5'-羟基末端的磷酸化在大多数正常细胞活动, 包括DNA重组、DNA复制和链断裂过程的DNA修复中, 发挥着关键的作用[1-3]，及时有效的修复DNA损伤在人类疾病的方面至关重要。一些外源性和内源性试剂，如化学物质[4]、电离辐射[5]以及核酸酶[6]，容易诱发链断裂和取代DNA 5'端的羟基基团。这一事实可能对需要5'-磷酸末端DNA愈合过程造成严重影响，甚至会导致DNA修复的失败。换句话说，5'-末端磷酸化在断键再结合完成之前通常是一个先决条件。
DNA磷酸化激酶活性的传统检测方法有放射自显影、32P自由基同位素标记和聚丙烯酰胺凝胶电泳[7-9]。但是这些方法具有一些局限性, 例如费时、复杂、效率低和昂贵，阻碍了这些方法的广泛应用。近年来，DNA磷酸化荧光检测方法的发展受到了较多的关注，由于其具有简便灵敏、高通量和性价比高等优点。Tang等通过使用分子信标对磷酸化过程进行筛选，发展了一种新型荧光检测方法。该方法利用T4多核苷酸激酶（PNK）和连接酶偶联反应，实现了对磷酸化过程灵敏检测[1]。Song等发展了一种实时监测T4 PNK活性和动力学的新方法，通过利用荧光标记的DNA发夹探针并结合Lambda核酸外切酶(λexo)的酶切反应。然而，设计特定染料标记的DNA发夹探针比较困难且成本高。另外，尽管这些荧光方法得到了一定的发展，但是进一步提高分析性能，例如改善灵敏度、线性范围等仍有迫切需求。因此，发展新型简便、灵敏和快速的多核苷酸激酶活性的检测方法仍然是一项极具挑战性的工作。