基于氧化石墨烯的荧光发夹探针检测多聚核苷酸激酶(2)
T4多核苷酸激酶（T4 PNK）发现于1965年[10], 属于5'激酶家族，它能催化三磷酸腺苷（ATP）的γ-磷酸基团转移到寡核苷酸或核酸的5'-羟基末端。T4 PNK已在检测DNA加合物[11]或寡核苷酸[12]，以及DNA损伤修复方面得到了广泛的应用[13]。T4 PNK是细胞核酸代谢必不可少的，特别是细胞内源的DNA损伤，它与许多人类疾病如文尔纳综合征、布卢姆综合征和罗特穆德-汤姆逊综合症有密切联系[33]。因此，快速准确的监测T4 PNK的活性在核酸代谢研究和分子靶标治疗中具有十分重要的价值。近年来，文献报道了检测T4 PNK活性的新型荧光传感方法。Liu等人通过耦合分裂脱氧核酶和连接引发脱氧核酶级联放大，实现了高灵敏检测T4 PNK活性[14]。尽管如此，发展新型简便、高效且灵敏的T4 PNK检测新方法一直有持续的需求。
石墨烯是碳纳米材料家族中的新成员, 它具有独特的电子和结构性能受到科研工作者的广泛关注[15,16]。此外，石墨烯具有高效的荧光共振能量转移（FRET）性质，从而使其成为开发荧光检测方法的候选材料之一[17]。另外，石墨烯是一种极好的能量受体具有超强的荧光猝灭能力，并被光物理计算所证实[17]。同时，石墨烯具有高的比表面积，通过非共价作用如氢键或π-π堆叠, 可在其表面负载大量生物分子。石墨烯已被用于成功构建各种性能优越的传感平台, 然而基于石墨烯平台检测生物酶活性的报道却十分少见[18,19]。
氧化石墨烯(GO)是石墨烯的一种重要衍生物，它不但具有平面结构且富含含氧功能基团(环氧基、羟基、羧基)，从而容易分散到各种溶剂中，极大的扩展了它的应用范围。GO通过非辐射偶极-偶极相互作用和荧光能量共振转移能有效猝灭荧光体的荧光，GO 可作为荧光体的通用型猝灭剂,并具有更高的猝灭效率。基于GO的检测平台，构建光学生物传感器检测蛋白质、生物小分子、金属离子和DNA相继出现。Lu等[20]发展了一种用于检测生物分子的石墨烯平台。GO跟核酸碱基和芳香族化合物有较强的非共价结合力，因此能够强烈吸附标记有荧光染料的单链DNA进而淬灭其荧光，加入目标DNA与荧光探针会形成刚性的双螺旋结构，使其能够从GO的表面脱离，恢复荧光从而实现检测。我们设想能否利用GO的独特性能构建多聚核苷酸激酶活性的检测平台。
本论文我们借助 λ exo对DNA底物的特异性酶切，它能够作用于双链DNA，沿5'→3'方向渐进性催化去除5'单核苷酸。最适底物是5'磷酸化的双链DNA，也能降解单链DNA和非磷酸化底物，但效率很低。同时，利用GO对DNA不同结构(单双链和片段)结合力大小的差别和其作为通用型荧光猝灭剂的性质，构建一种新型的荧光传感器检测多核苷酸激酶的活性。与传统的方法相比，该方法简便、快速灵敏，不仅对进一步研究与疾病相关的生化过程有重要意义，而且对分子靶疗法和核苷酸激酶靶向药物的筛选有一定参考价值。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：荧光光谱仪：JASCO FP-750 日本分光公司; 离心机：型号TDL-4，上海安享科学仪器厂; pH计；超声波清洗仪 型号RQ-500B，恒温水槽。
试剂：氧化石墨烯固体（通过hummer方法制备，用灭菌水溶解成储备液1mg/mL）；T4 多聚核苷酸激酶(T4 PNK), KF ploymerase，EcoRI核酸内切酶和Lambda核酸外切酶(λ exo)购自纽英伦生物技术（北京）有限公司。
5'-三磷酸腺苷二钠（ATP）盐水溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
反应液组成为1×T4 PNK反应缓冲液 [70 mM Tris-HCl (pH7.6) , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT]；检测液组成为10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2，pH=8.0