对硝基苯-α-D-葡萄糖苷的合成与工艺(3)
实验号 缓冲液(ul) 酶量(ul) 多糖(ul) 底物(ul) 吸光度
1 2600 0 0 400 A1
2 2580 20 0 400 A2
3 1695 0 50 400 A3
4 1675 20 50 400 A4
在上表中通过计录不同时间下吸光度的数值，套入抑制率计算公式即可得出结果。这类研究可以帮助我们筛选更加有效的糖苷酶抑制剂，提升治愈糖尿病的效果，在医疗诊断上功不可没。
在生物领域，利用这种糖苷酶的检测方法可以筛选高效生产酶的菌株。例如姚卫荣等以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷为底物检测在不同PH、温度、底物浓度下对纤维素体系下硝基苯基-β-D-葡萄糖苷的酶活性，以此方法来筛选菌种，并成功选育出高产菌株[7]。
除了对硝基苯酚以外，2--氯-4硝基-苯酚也能够在特定条件下发色，该种芳苷试剂在临床诊断中也已经被广泛应用，原理和对硝基苯酚一样，在特定波长下显色，通过比较该波长下吸光度上升的快慢即可推断酶的水解能力。例如王蓉等首先确定底物浓度、最适温度、PH值以及不同离子对β-D-半乳糖苷酶的水解能力的影响，然后以β-D-半乳糖苷为底物研究不同人群体内β-D-半乳糖苷酶的水解能力，统计相应的GAL值，作为肾小管病变的重要指标[8]。李兴民等合成2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷，以此为底物探索了PH、血清对α-L-岩藻糖苷酶水解底物速率的影响，这种糖苷试剂可以用于肝癌的早期检测[9]。以上这些研究均展现出糖苷试剂对临床医学上疾病检测的巨大贡献。
由于糖配基的复杂性以及构型的不同，至今人们已经发现的糖苷酶成千上万，但并不是每一种酶都找到了相应的作用底物，而且随着糖苷酶在临床诊断中发挥的作用日益变大，对糖苷试剂和新的糖苷酶底物需求也将越来越大，研究出一种经济实用而又绿色化合成糖苷酶底物的方法势在必行。
2.2 糖苷的合成方法
合成对硝基苯-α-D-葡萄糖苷主要有以下的三种合成方法：Koenigs-Knorr法、Helferich合成法、酶催化法。前两种方法过程基本一样，都是先采取保护羟基，然后与对硝基苯酚发生反应，最后脱去保护基得到目标产物，在这其中不同的糖化学工作者对反应过程中的操作条件以及催化剂进行了探索，作者将对这些改进与工艺条件进行比较，阐释采用方法中的优缺点。
2.2.1 Koenigs-Knorr法
早在1901年，Koenigs和Knorr利用乙酰化糖与溴化氢发生反应，制得溴代糖，由于溴原子的相对原子质量比较大，所以它是很好的离去基团，离去后在异头碳上生成碳正离子，使得糖基有很高的活性，可以很容易与亲核试剂发生反应[10]。反应方程式如下：
这类方法通常使用的催化剂是银盐和汞盐，例如溴化汞、氧化银、碳酸银、氧化汞、氰化汞等等，故该法也通常被称为银盐法。但是该法存在着诸多缺点，首先溴代糖不易保存，需要现做现用，反应要尽量在无光条件下发生反应，否则溴代葡萄糖容易分解，其次催化剂的价格相对比较高，而且重金属盐的毒性比较大，不符合当代绿色化学的要求。除此之外这种方法合成的糖苷立体选择性不高，反应过程中需要加多种促进剂[11]。以上原因在很大程度上限制了这种方法的发展。在下文合成溴代糖过程中溴代试剂可以采用磷和液溴或者溴化氢的乙酸溶液，无论采用哪种试剂，对人体以及环境的危害都非常大。同时反应过程中要尽量使反应物处在无水避光的条件下，实验条件苛刻，不容易制备成功，而且在制备溴代糖后无法经过柱层析提纯，柱层析会使溴代糖变坏。下文中合成了2,4二氯苯基-β-D-四乙酰基葡萄糖苷，实验过程中TLC检测只发现了一个产物点，而核磁图谱显示出两种构型的产物，比例在1：2左右，由此也说明虽然利用溴代糖为反应物可以得到相对较高的产率，但立体选择性不好，产物无法经过柱层析分离等缺点。
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