1。2。2 amyZ基因的扩增

以粘细菌的基因组DNA为模板，以 amyZ-F1和amyZ-R1。

PCR 反应体系(50 µL)如下：

5× PrimeStar Buffer (Mg2+plus)                  10。0 μL

dNTP Mixture(2。5mM)                         4。0μL

amyZ-F1                                    1。0 μL

amyZ-R1                                    1。0 μL

模板 DNA(20ng·µL-1 )                        1。0 μL

PrimeStar HS DNA polymerase 5 UµL-1           0。5 μL

无菌 ddH2O                                 32。5 μL

反应总体积                                  50。0 μL

PCR 扩增程序：98 ℃ 10 s，57℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃10 min。扩增产物经 0。75%琼脂糖凝胶电泳检测，回收试剂盒回收后储于-20 ℃。

1。2。3amyZ基因片段与pMD19 T-simple连接

将amyZ的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收后与 pMD19-T 载体相连。

10μL 酶连反应体系如下：

10×T4 ligase buffer          1。0μL

pMD19-T Vector            1。0μL

PCR 产物                 4。0μL

T4 ligase                   0。5μL

灭菌 ddH2O               3。5 μL

总体积                    10。0μL

酶连体系于 16℃水浴过夜，转化至 E。coli DH5α，挑取阳性克隆至3 mL 液体 LB（Amp+），37℃，180 rpm 培养16 h后提质粒电泳，双酶切验证。

双酶切体系如下：

重组质粒                6。0μL

10×H buffer              1。0 μL

NdeI (10 U·μL -1 )         0。5 μL

XhoI (10U·μL -1 )         0。5 μL

灭菌 ddH2O             2。0 μL

总体积                  10 μL

37 ℃酶切过夜，加5 μL 10×loading buffer 终止反应。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测是否含有正确大小的插入片段。将验证无误的阳性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1。2。4 amyZ基因片段与pET-29a连接来自~吹冰、论文|网www.chuibin.com +QQ752018766-

提取克隆质粒与pET-29a用NdeI和XhoI进行双酶切。酶切体系同 1。2。3。双酶切产物 0。75 %琼脂糖凝胶电泳，根据DNA回收试剂盒操作说明，切胶回收目的片段和载体片段。将目的基因片段和pET-29a片段按一定比例混合，在DNA 连接酶作用下，16℃水浴过夜。

将酶连好的重组质粒pET-29a-amyZ 转化到 E。coli DH5α感受态细胞中。挑取单克隆至液体LB培养基中培养。提取质粒电泳检测大小，双酶切验证，菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。将测序无误的载体质粒转化到大肠杆菌E。coli BL21（DE3）感受态细胞中，接种培养，加等体积 30%甘油于-70℃保藏菌株。