灵芝两阶段发酵研究+文献综述(5)
(4) 大孔吸附树脂法
大孔吸附树脂是一种具有大孔结构高分子分离材料。大孔吸附树脂法具有选择性好、吸附容量大、再生处理方便、吸附迅速以及解吸容易等优点，现在已被广泛应用分离和提取天然产物的有效成分。比如提取生物碱、黄酮、皂苷及核苷类成分。王刚等以动态吸附洗脱率、静态饱和吸附量作为考察指标，从6种大孔树脂筛选最优HPD-100型树脂，可以有效的去除杂质，可提取提取物中黄酮。王世宇等用Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂与大孔吸附树脂联用纯化香菇多糖，通过单因素实验筛选出合适药液浓缩浓度、澄清剂凝温度、澄清剂用量，在最优条件下显示使用这种方法可以很大程度地提高香菇多糖的提取率同时又能缩短生产周期，损失较少的有效成分，降低生产成本等优点。
近年来，人们应用大孔吸附树脂法提取分离一些三萜类化合物。钱竹等应用这项技术提取分离发酵液中三萜类物质，他们以对三萜类物质的吸附和解吸能力为指标从四种树脂中筛选出AB28树脂，在优化的上样条件下对三萜的吸附量能达到81837mg/g；同时确定了最佳的洗脱条件，用不同浓度的乙醇梯度洗脱。
综上所述，首先由于灵芝子实体、灵芝菌丝体或发酵液等不同来源的材料所含的三萜类化合物种类和含量不同，需根据不同的实验材料采用不同的提取方法；其次要根据实验选择提取方法，要考虑是为了优化总三萜还是为了进一步分离三萜类化合物分离纯化；最后要考虑生产成本或设施的条件，选择采取一种或几种相结合的提取方法来获得灵芝三萜类化合物。
1.2.6灵芝三萜类化合物的分离纯化
(1) 灵芝酸总酸的分离纯化类型
1.原料用有机溶剂提取后，用柱层析对浸膏提取物进行分离。2.原料采用有机溶剂提取后，分出总酸部分后，再进行柱层析分离。3.原料用有机溶剂提取后，先用重氮甲烷把它的总酸部分进行甲基化后，最后再采用柱层析分离。
(2) 硅胶吸附柱色谱法
目前硅胶吸附柱色谱法仍是分离纯化三萜类化合物的主要手段之一。选择这种方法进行分离纯化时，我们要首先要选择合适的色谱柱、硅胶型号和洗脱溶剂。其中对洗脱溶剂系统的选择可以在查阅相关文献后，结合分析型薄层色谱或高效液相色谱进行优化，这样有助于节省时间，提高分离效果。陈若芸等从赤芝孢子粉酸性部分经过反复柱层析、低压柱层析、减压柱层析得到一个新的四环三萜类化合物，命名为ganosporeric acid A，另外还得到灵芝酸B、C和E等。李平作等将灵芝发酵液过滤后，用正丁醇和水提取3次，饱和正丁醇浓缩液蒸干后采用硅胶柱反复层析(洗脱溶剂甲醇和氯仿)，最后得到三种灵芝酸。罗俊等将赤芝子实体A-F吹冰个三萜组分中的E组分经过反复柱层析分离，得到一种新的化合物：羊毛甾烷型灵芝酸LM2。郝瑞霞等将灵芝子实体的氯仿浸膏先用硅胶柱层析分离(石油醚—丙酮梯度洗脱)，再将得到的组分8用MCI柱层析分离(甲醇—水梯度洗脱)，最后将70%甲醇洗脱得到的组分再使用硅胶(硅胶H)进行石油醚—丙酮梯度洗脱，从灵芝子实体分离纯化出两个新的天然三萜类化合物，经结构鉴定为methyl ganoderate D和methyl lucidenate D。
(2) 高效液相色谱法
与硅胶吸附柱色谱法相比，高效液相色谱法具有高压、高速、高灵敏度等的特点。Lin等用反相色谱法分离纯化赤芝菌丝体的甲醇提取物，得到了14中灵芝三萜类化合物。Chen等用RP-HPLC从灵芝菌丝体甲醇提取物中分离纯化得到灵芝酸A、B、C1、C2，用乙腈：2%乙酸=1:4-1:2的洗脱溶剂。Tang等使用RP-HPLC的半制备型高效液相色谱法分离纯化500g的灵芝菌丝体，得到0.568g的灵芝酸T和0.12g的灵芝酸Me，同时发现温度会影响分离效果。