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粪产碱杆菌NicA基因的烟酸降解功能鉴定(3)
1 材料与方法
1.1 试剂、仪器及培养基
1.1.1 试剂及所用仪器
本实验室已发现粪产碱杆菌ZD05(Alcaligenes faecalis ZD05)中有烟酸代谢的调控基因簇 Nic A,并已提取了其基因组DNA。
大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)购于南京百斯凯科技有限公司;申氏杆菌(Shinella sp HZN7)由本实验室筛选获得。载体质粒MCS2,具有Km抗性,为本实验室保存。
抗生素氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)、卡那霉素(Kanamycin,Km)购于上海生工生物工程股份有限公司;本文中所用抗生素的工作浓度分别为:氨苄青霉素(Amp),100 mg/L;卡那霉素(Km),100 mg/L;
DNA凝胶回收试剂盒Gel/PCR Extraction Kit、质粒小提试剂盒Plamid Miniprep Kit、转染试剂盒LipofectaminTM 2000(购自生工生物工程公司);
主要仪器:高速离心机(CT15RT);紫外扫描仪(JASCO V-550, Japan);电泳仪(Tanon EPS300);恒温水浴锅(DK-8D);PCR仪(Bioer XP Cycle);恒温振荡摇床(IS-RSD3);超净工作台(AIRTECH);移液枪(Eppendorf);超低温冰箱(MDF-382E(CN));
PCR引物合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。
Taq DNA聚合酶、DNA克隆T载体(pMD18-T)和T4连接酶购于大连宝生物工程有限公司。
1.1.2 培养基
无机盐培养基(Mineral Salts Medium,MSM):1.5 g/L K2HPO4,0.5 g/L KH2PO4,0.2 g/L MgSO4•7H2O,1.0 g/L NH4NO3,1.0 g/L NaCl及1 ml/L微量元素溶液。用双蒸水定容至1 L,pH 7.0~7.5。
LB培养基(Luria-Bertani medium):10.0 g/L 蛋白胨,5.0 g/L 酵母膏,和10.0 g/LNaCl,双蒸水定容至1 L,pH 7.0。
以上培养基均经过高压蒸汽灭菌(121℃,30 min)。固体培养基添加1.5%(w/v)的琼脂。
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大肠杆菌可诱导性前噬菌体宿主谱改造试验
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