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β-1,3-葡聚糖酶LamC的结晶条件筛选(3)
2.4重组酶LamC的诱导表达
将表达菌株Origami 2(DE3)-pET 32a-lamC划线活化,接种单菌落于含有100mg/mL氨苄霉素(Amp)的3mL液体LB培养基中,37°C,180rpm振荡过夜。取1mL菌液转接于100mL液体LB培养基(含100mg/mLAmp),37°C,180rpm培养至OD600为0.6左右,加入1M IPTG20μL,18°C,180rpm培养24h,8000rpm离心12分钟,弃去上清。沉淀用pH7.0 Tris-HCl将菌体吹悬,超声破碎后,12000rpm,4°C离心20分钟,收集上清。
2.5重组酶LamC的纯化
Ni 2+ -NTA 亲和层析柱预先以两倍柱体积的20 mMTris•HCl(pH 7.0)平衡,将含有重组酶LamC的破碎液离心上清上样至Ni 2+ -NTA亲和层析柱,4 ℃孵育 1 hr,以5倍柱体积含50 mM咪唑的20 mMTris•HCl(pH 7.0)洗去杂蛋白,然后以含100mM、200 mM、300 mM咪唑的20 mMTris•HCl(pH7.0,)缓冲液进行分步洗脱2倍柱体积,收集洗脱液,进行12% SDS-PAGE电泳进行纯度检测。
2.6重组酶LamC的SDS-PAGE检测
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