通过荧光基因标记研究苜蓿中华根瘤菌nifH缺失株的竞争定殖能力(3)
1.3苜蓿所用营养液及培养条件
材料 用量
Na2HPO4•2H2O 0.15g（Na2HPO4•12H2O 0.213g）
KH2PO4 0.1g
CaCl2•2H2O 0.1g(无水CaCl2 0.0755g )
MgSO4•7H2O 0.1g（无水MgSO4 0.0586g）
柠檬酸铁 5mg
表1.无氮营养液配方(1000ml)
材料 用量
H3BO3 2.86g
ZnSO4•7H2O 0.22g
MnSO4•4H2O 2.03g( MnSO4•H2O 1.538g)
NaMoO4•7H2O 0.08g（NaMoO4•4H2O 0.058g）
CuSO4•5H2O 0.08g(CuSO4•2H2O 0.06g/无水CuSO4 0.048g)
表2.微量元素营养液配方（1000*）1000ml
1.4 抗生素与浓度
庆大霉素（Gen）450µg/ml；链霉素（Str）100µg/ml。
1.5 荧光蛋白基因的标记
1.5.1 质粒DNA提取 在含有相应抗生素的培养液中过夜培养待抽提质粒的菌株，预先准备用冰预冷好的100μL溶液I用于重悬细菌沉淀，重悬时要剧烈震荡。重悬完成后加入现配溶液Ⅱ 200μL静置5 min。再加用冰预冷的溶液Ⅲ 150μL，冰上放置五分钟。4 ℃，12000 g 条件下微量离心机离心 5 min，离心后上清转移至另一离心管中，加入等量酚：氯仿，于 4 ℃ 12000 g 条件下微量离心机离心 2 min，将上清转移，用 2 V 无水乙醇沉淀DNA。振荡混匀，于-20 ℃放置 30 min。用微量离心管机 12000 g 离心 10 min。吸水纸吸去管内残留的上清液，并放在纸上晾干。70% 酒精在4℃条件下洗涤得到的沉淀，弃上清后冷冻真空抽干。用50 μL 含 RNA 酶（20 μg/mL）的 TE 重新溶解核酸，储存于-20 ℃条件下。
1.5.2 制备根瘤菌感受态细胞和电刺激转化 活化根瘤菌菌株后接种至20ml PY培养基中, 28℃培养，180RPM, 菌液吸光度OD600 达到0.6左右时，立刻开始冰浴 10~15min，期间可不时地轻摇，使整个离心管均匀冷冻。4℃下 5000rpm 离心 10min，去除上清。以等量 4℃无菌水洗涤两遍。随后以 1ml的 15％甘油重悬菌体，重悬后以每管50μL的量分装到灭菌PCR 管中并在-70℃保存。取两管感受态细胞冰上解冻。然后在含感受态细胞的离心管中加入1ul 待转入质粒，无菌水作为对照。混合物转入0.2cm电转化杯中，在电转化过程中液体要保持与电极的接触。用 2.5kv 电压电击56ms。电击后及时将菌液转入 1mL新鲜 PY 培养基，28℃，120rpm 条件下振荡培养根瘤菌倍增时间的两倍时长。培养完后取其中100ul 菌液，涂布到含相应抗性平板上，剩余菌液转入1.5ml离心管中，12000rpm 离心 2mins，倒去上清液，以新鲜的 100ul PY 液体培养基重悬菌体，并涂布于相应抗性平板上。28℃倒置培养 3～4d 直至长出转化子。