大肠杆菌细胞表面展示条件的初步优化和实验分析(4)
IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)配方如下：在8 ml蒸馏水中溶解2 g IPTG后，用蒸馏水定容至10 ml，用0.22 μm滤器过滤除菌，分装成1 ml小份贮存于-20℃。
2.1.3.2质粒提取试剂
溶液Ⅰ：50.0 mrnol/L Glucose，25.0 mmol/L Tris•HCl (pH8.0)，10.0 mmol/L EDTA (pH8.0)；
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1% SDS；
溶液Ⅲ(每100 mL)：5.0 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL；
TE：10.0 mmol/L Tris•HCl，1.0 mmol/L EDTA (pH8.0)；
2.1.3.3 琼脂糖凝胶电泳所需试剂
TAE Buffer：40.0 mmol/L Tris-乙酸，1.0 mmol/L EDTA (pH8.0)；
2.1.3.4 GFP荧光强度测定所需试剂
PBS(PH 7.4)：NaCl 4.0 g，KCl 0.1 g，Na2HPO4•12H2O 1.45 g，KH2PO4 0.135 g，去离子水定容至0.5 L，调PH至7.4。
2.1.4 仪器设备
可见光分光光度计，高速冷冻离心机，凝胶电泳仪，凝胶成像仪，荧光分光光度计。
可见分光光度计基本使用方法：
① 按“GO TO λ”键，输入设定波长；
②四个比色皿，其中R位置放置参比试样，其余三个放入待测试样。将比色皿放入样品池内的比色皿架中，盖上样品池盖；
② 将参比试样推入光路，按“ABS%”键，使仪器自动调零和置满度；
④然后将待测试样推入光路，显示试样的吸光度值；
高速冷冻离心机基本使用方法：
①检查仪器。
②选择转头。
③接通电源，打开电源开关。
④将待离心的液体装入合适的离心管中，并对称的放入转头中。
⑤调节速度和时间。
⑥打开开关。
⑦离心结束后自动关机、关闭冷冻开关、电源开关、切断电源。
⑧将转头取出，将离心机的盖子敞开放置。
⑨收集离心物，洗净离心管。
2.2 实验方法
2.2.1 质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定
2.2.1.1 大肠杆菌质粒DNA的少量提取
（1）实验原理
根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH 12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH 4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快速，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去[17]。
（2）实验方法
质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，本次实验采用了碱裂解法和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取法两种方法：
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：
①接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2 ml LB培养基，37℃振荡培养过夜。
②取1.5 ml菌体于Ep管，以12000 g离心30 s，将剩余培养物贮存于4℃。
③弃上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
④将细菌沉淀重悬于100 ul用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡。
⑤加入200 ul新配置的溶液Ⅱ。加入150 ul用冰预冷的溶液Ⅲ。
⑥用微量离心机于4℃以12000 g离心5 min，将上清转移到另一Ep管中。
⑦用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2 min。
⑧用微量离心机于4℃以12000 g离心5 min。
⑨小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。
⑩用1 mL 70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤10所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10 min。
（3）SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取法：
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