pXZP008载体改造及其应用+文献综述
毕业论文关键词：载体改造；pXZP008；CO-IP；OsAGO2；OsPRMT5
An review on pXZP008 vector transformation and application
Abstract：This experiment is to explore a fast, convenient and low cost carrier, namely by inserting pCLEAN-G265 in pXZP008 ubiquitin promoter (Ubi-promoter), and the transformation of the pXZP008 vector; transformation system using rice protoplast transient, rice OsAGO2, OsPRMT5 genes were cloned into expression vector pXZP008-Ubi and transformed into rice in the protoplast, and OsAGO2 and OsPRMT5 were verified the interaction by CO-IP. The construction and application of pXZP008-Ubi plasmid provides a rapid and effective method for gene recombination, and lays a foundation for the study of its function and protein interaction.
Key words: vector transformation; pXZP008; CO-IP; OsAGO2; OsPRMT5
目 录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与仪器 2
1.1实验材料 2
1.1.1 植物 2
1.1.2引物 2
1.1.3质粒和菌株 2
1.1.4培养基 3
1.2主要仪器 3
2.实验方法 3
2.1 pXZP008载体的改造 3
2.1.1 pCLEAN-G265的泛素启动子的克隆 3
2.1.2 DNA的回收 3
2.1.3 pXZP008和pCLEAN-G265载体连接 3
2.1.4大肠杆菌JM109超级感受态细胞的制备 4
2.1.5热激转化大肠杆菌 4
2.1.6菌落PCR鉴定 4
2.1.7 质粒提取 4
2.1.8质粒测序 5
2.2 pXZP008-Flag: OsAGO2载体的构建 5
2.2.1 OsAGO2的克隆 5
2.2.2 酶切与pXZP008载体连接 5
2.3 pXZP008-HA:OsPRMT5载体的构建 6
2.3.1 OsPRMT5的克隆 6
2.3.2 酶切与pXZP008载体连接 6
2.4 水稻原生质体的提取 7
2.4.1水稻黄化苗的培养 7
2.4.2 水稻原生质体的分离 7
2.5蛋白表达 7
2.5.1转化水稻原生质体 7
2.5.2检测总蛋白 7
2.6 CO-IP验证 7
2.6.1 SDS-PAGE 7
2.6.2转膜 8
2.6.3免疫反应 8
3．结果与分析 8
3.1 pXZP008_Ubi克隆结果与分析 9
3.2 pXZP008-Flag: OsAGO2的构建结果与验证 9
3.3 pXZP008-HA:OsPRMT5的的构建结果与验证 10
3.4 表达载体pXZP008-Flag: OsAGO2和 pXZP008-HA:OsPRMT5的构建结果与分析 10
3.5 pXZP008-Flag: OsAGO2和 pXZP008-HA:OsPRMT5免疫反应的结果与分析 11
4．讨论 11
致谢 12
参考文献 12
关于pXZP008载体改造与应用
引言：pXZP008载体是一种真核生物瞬时表达载体，这个载体上有一段多克隆位点(MCS)，而且这段多克隆位点有很常见的酶切位点。水稻OsAGO2为AGO蛋白家族的一种，AGO蛋白是一类高度保守的蛋白家族，具较高的亲水性[2]。在植物分生组织的文持以及生长时相转换的控制过程中均起重要作用[3-4]，且该蛋白在水稻花药、愈伤组织、小穗中均有表达[5]。OsPRMT5是水稻PRMT基因家族的基因，其在调控植物发育中有重要作用[6]。CO-IP是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法[7-8]。泛素(ubiquitin, Ub)是一种高度保守的小分子蛋白，由76个氨基酸组成，启动子是一种顺式作用(cis-acting)正调控元件，其强弱决定基因转录水平的高低，泛素启动子在增强基因表达的长期性，稳定性等方面有显著功效[9-12]。