猪皮肤成纤维细胞骨髓细胞和卵巢颗粒细胞的分离培养(3)
1.2.2骨髓间充质干细胞的取材及处理 股骨中间剁断，暴露出骨髓，用镊子刮去表层骨髓，取里层骨髓与培养皿中，一块放胰酶离心管中消化，用镊子夹碎准备2个1.5ml离心管，分别加入1ml的培养基，并将骨髓放入离心管中，剪碎。将悬液用移液枪吸起，放入培养瓶中。用胰酶消化的骨髓放入培养瓶中，铺平，再用移液枪吸1ml培养基在离心管中，吹打，吸入培养瓶中，标来源，时间。用原代培养基的骨髓分别放入培养瓶中，吸1ml培养基于离心管中，吹打，混匀，将液体吸入培养瓶，铺平，倒置的培养瓶6h后翻转过来。做好标记。用酒精将培养瓶消毒后放入37°C培养箱中。2天后换液。
1.2.3颗粒细胞的取材及处理
（1）未成熟卵母细胞周围的颗粒细胞 取卵泡液1ml于1.5ml离心管中，3000r/min离心3min，去上清液。加入含1%双抗的PBS，混匀，3000r/min离心3min，去上清液，加1ml的培养液（DMEM+20%FBS+600ul双抗）于离心管中，混匀，离心3000r/min 3min，去上清液，再加600ul含20%胎牛血清的培养基于离心管中，接种于24孔板上，每孔接种200ul，再急加600ul的培养液。置 37℃ 5% CO 2 培养箱内培养。每2d更换一次培养液。
（2）取成熟卵母细胞周围的颗粒细胞 48h后培养的成熟卵母细胞，用透明质酸消化后，将卵母细胞吸出，剩余的液体装在1.5ml离心管中，3000r/min离心3min，去上清液。加入1ml含1%双抗的PBS，混匀，3000r/min离心3min，去上清液，加1ml的培养液（DMEM+20%FBS+600ul双抗）于离心管中，混匀，离心3000r/min 3min，去上清液，再加600ul含20%胎牛血清的培养基于离心管中，接种于24孔板上，每孔接种200ul，再急加600ul的培养液。置 37℃ 5% CO 2 培养箱内培养。每2d更换一次培养液。
1.2.4传代培养 待原代细胞长到80%汇合，倒去原培养液，用PBS洗3遍，加入2ml预热的胰酶，敲打，直至细胞浮起，加入2ml的细胞培养液终止消化，用枪头轻轻吹打，将消化后的细胞混合液转移至1.5ml离心管中，3000r/min 离心3min，弃上清液，加入1ml体细胞培养液重悬，相同条件下反复离心3次，1:3接种于24孔板中。置 37℃ 5% CO 2 培养箱内培养。每2d换一次液。
1.2.5冻存及复苏
取培养较好的细胞，用 0.25%胰蛋白酶消化收集，加入体细胞培养基终止消化，轻轻吹打细胞，以使细胞游离，3000r/min离心3min，去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入 1ml 细胞冷冻液（DMEM+20%FBS+10%DMSO），轻轻吹打均匀，然后分装入无菌塑料冻存管中，每支冻存管加液1.0~2.0ml,封闭冻存管，标明细胞的名称、代数及冻存日期，分别将冻存管置于4℃平衡40min,-20℃保存60min，-80℃超低温冰箱后即可投入-196℃液氮中长期保存。
复苏时，将冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴中复温，轻轻摇晃，待细胞完全融化后，吸出细胞悬液注入1.5ml离心管，1000r/min离心5min，倾去上清液。重复用细胞培养液清洗、低速离心5min 3次，倾去上清液，以除去二甲基亚砜，新鲜培养液重悬细胞，用培养液适当稀释， 接种至培养瓶中，置37℃ 5% CO 2 培养箱内培养，待细胞贴壁后更换培养液。