番茄免疫受体蛋白Sw-5b与番茄斑萎病毒移动蛋白NSm互作分子机制研究(4)
BiFC融合载体的构建及鉴定，通过分析 Sw-5b 和 Nsm 基因序列上的克隆位点，添加 BamH I和 XhoI酶切位点，以连入目的基因的p2300-Sw-5b为模板进行PCR扩增。PCR产物和pSPYCE和pSPYNE载体 BamH I和 XhoI双酶切后直接回收，4℃放置冰箱连接过夜，转化，筛选后，凝胶电泳检测，割胶回收，回收产物送上海生工公司测序。测序结果正确，将构建成功的载体分别命名为psp-cYFE-Sw-5b和psp-NSm-nYFE。
构建pET28-NSm与pGEX-NTD1原核表达载体。使用BamH I和EcoR I将pGEX-4T质粒载体进行双酶切，用BamH I和Xho I进行将pET28载体质粒双酶切，酶切产物直接回收。以p2300-Sw-5b为模板PCR扩增扩增NTD1基因。琼脂糖电泳后，切胶纯化回收NTD1基因片段，与已经回收后的pGEX-4T质粒片段4℃冰箱连接过夜。转化 DH5ɑ，菌落PCR筛选，阳性克隆测序，查看测序结果。通过PCR扩增，以pHMTC-NSm为模板PCR扩增NSm，双酶切，直接回收，与pET28质粒酶切产物片段连接，4℃过夜。转化筛选后获得重组质粒pET28-NSm。
1.2.3 重组质粒转化根癌农杆菌GV3101
制备根癌农杆菌GV3101感受态细胞，用电激的方法将重组质粒转化到GV3101细胞中，28℃，3 h,吸取100μL涂布于含Kan 100μg/mL的LB固体培养基上，放置28℃恒温培养箱中，48 h后，选取平板上单菌落，放置在加有抗生素的5mL 液体LB培养基中，摇菌过夜。
1.2.4 根癌农杆菌注射烟草及瞬时表达
将菌液悬浮农杆菌处理液中，加入农杆菌处理液，调整OD约为0.2，28℃恒温培养箱中避光放置3个小时后，相互作用的的两种蛋白菌液等体积混合放入2ml EP管中，使用1ml 注射器注射入本氏烟草，每株注射处于顶部叶子下方的3片叶子，每种混合液注射半片叶子。存在无重组质粒的农杆菌菌液注射烟草作为阴性对照。
1.2.5 蛋白提取及免疫共沉淀
将GV3101介导瞬时表达24-72 h后的烟草叶片剪取约0.2g ，在研钵中添加液氮，充分研磨，反复三次后，使之成为成粉末。用2.0-3.0 mL IP buffer悬浮，4℃、20000rpm离心10-15 min，保留上清，除去磨碎的细胞残骸。
1.2.6 SDS-PAGE与Western blot检测
将蛋白样品放在95℃中加热5min ，加入终浓度为1×的loading buffer ，于10%的聚丙烯酞胺凝胶进行电泳，电压为80V 1h、120V 1.5h，使用托马斯亮蓝进行染色30min，加入洗脱液吸取染色，再光下观察分析。使用半干的方法将蛋白的条带转移到PVDF膜上，加入的一抗为anti-Flag或NSm抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG，开始Western blot鉴定。
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