油菜素甾醇信号转录因子StBZR1基因的克隆及在马铃薯块茎形成中的初步功能分析(3)
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料
马铃薯栽培种Désirée。
1．1．2 菌株和载体
本实验采用从大连TaKaRa生物工程有限公司采购的pUCM-T载体及由本实验保存的大肠杆菌（Escherzchia coli）DH5α。
1．1．3 酶与化学试剂
DNA提取采用TIANGEN公司的Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）；RNA提取采用TIANGEN公司的RNA simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒（离心柱型）；胶回收采用Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒；质粒提取采用上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒（离心柱型）；PCR所用dNTP、Mg2+、buffer、Taq DNA聚合酶等试剂购于上海博彩生物科技有限公司；常规化学试剂均为分析纯试剂。
1．2 方法
取马铃薯栽培种Désirée 的新鲜幼嫩的组织根、茎、叶、匍匐茎、块茎五种材料，分别提取DNA和RNA，并且进行相应的电泳检测提取效果（条带大小、亮度），然后将RNA反转录，获得的cDNA进行半定量PCR检测基因的表达。
1．2．1 DNA提取
取植物新鲜组织约100 mg或者干重组织打约30 mg，加入液氮，充分研磨。将研磨之后的粉末迅速转移，放入预先装有700 μL 65 ℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中应该提前加入巯基乙醇），迅速颠倒混匀。将离心管放在65 ℃水浴20 min，水浴过程中需颠倒离心管，使样品混合数次。之后再加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm离心5 min。将所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。将混匀的液体转移到吸附柱CB3中，12,000 rpm离心30 s，弃掉滤液。向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，12,000 rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12,000 rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复。将吸附柱CB3放回收集管中12,000 rpm离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温，放置数分钟，以彻底晾干残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2- 5min，然后12,000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中。
1．2．2 RNA提取
将组织在液氮中磨碎。每50-100 mg组织加入1 ml裂解液RZ，然后进行匀浆处理。将样品在15-30 ℃放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。然后在4 ℃ 12,000 rpm离心5 min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。加入200 μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。4 ℃ 12,000 rpm离心10 min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层，无色的水相。RNA主要存在于水相中。把水相转移到新管中，缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3。4 ℃ 12,000 rpm离心30 s，弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR3中加入500 μL去蛋白液RD，4 ℃ 12,000 rpm离心30 s，弃废液。向吸附柱CR3中加入600 μL漂洗液RW，室温静置2 min。4 ℃ 12,000 rpm离心30 s，弃废液。重复。将吸附柱转入2 ml收集管中，4 ℃ 12,000 rpm离心2 min，去除残余液体。将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加30-100 μL RNase-Free ddH2O，室温放置2 min。4 ℃ 12,000 rpm离心2 min。