HDAC8在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用及其机制的研究(2)
组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一类可水解组蛋白赖氨酸乙酰基的蛋白酶，组蛋白的去乙酰化可促进其与DNA的结合而导致染色质凝缩，以抑制DNA的转录[7,8]。长期以来，人们认为HDACs仅仅作用于细胞核的组蛋白，但越来越多的研究表明HDACs还参与了其它的生理及病理活动，比如肿瘤、神经退行性疾病以及机体代谢的调控[9-11]。
目前已鉴定出了18种HDACs，并根据其蛋白序列及结构域的差异而分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四个家族[12]，HDAC8归属于家族Ⅰ[13]。HDAC8作为一种广泛分布于细胞质的去乙酰化酶，它可作用于多种非组蛋白底物，参与不同生理活动的调节。以往的研究表明，HDAC8可共定位并结合平滑肌动蛋白（α-SMA），从而调节平滑肌的收缩[14-16]。在卵母细胞减数分裂中，HDAC8还参与了SMC3乙酰化水平的调节，并调控cohesin复合体的功能以及姐妹染色单体的正常分离[17]。HDAC8的敲低可抑制结肠和子宫颈癌细胞的分化[9]，而HDAC8的上调则促进肝癌细胞的增殖[18]。此外，HDAC8还作用于中心体的聚合并介导病原微生物对宿主的感染[19]。
本研究旨在揭示HDAC8在小鼠卵母细胞减数分裂中的潜在作用。试验结果表明HDAC8主要分布在卵母细胞纺锤体两极，并调控γ-tubulin的定位，还作用于纺锤体的组装和染色体排列，从而确保正常整倍体的产生。
1 材料与方法
1.1 实验动物
实验使用健康的ICR雌鼠（4-6周龄），并按照南京农业大学实验动物饲养与使用的相关规定将其短期饲养于实验动物房。
1.2 实验抗体
名称 来源
兔源anti-HDAC8抗体 Abcam（Cambridge, MA, USA）
鼠源anti-α-tubulin-FITC抗体 Sigma（St. Louis, MO, USA）
鼠源anti-acetyl-α-tubulin抗体 Sigma（St. Louis, MO, USA）
鼠源anti-γ-tubulin抗体 Sigma（St. Louis, MO, USA）
人源anti-centromere抗体 Antibodies Incorporated（Davis, CA, USA）
FITC标记山羊抗兔 IgG (H + L) 中杉金桥生物技术公司（中国，北京）
TRITC标记山羊抗兔IgG (H + L) 中杉金桥生物技术公司（中国，北京）
FITC标记山羊抗鼠IgG (H + L) 中杉金桥生物技术公司（中国，北京）
1.3 卵母细胞采集与培养
1.3.1 卵母细胞采集 将4-6周龄ICR雌鼠以脊椎脱臼处死，通过外科手术取出其两侧卵巢，并放于事先在培养箱预热的M2培养滴中。在培养皿中用切剖法分离卵母细胞与卵巢组织，然后向其中加入预热的M2培养液，在解剖显微镜下捡出所需的GV期卵母细胞。
1.3.2 卵母细胞体外培养 将GV期卵母细胞移至M2培养滴中清洗其附带杂质，然后移至预热的M16培养滴，并用石蜡油密封培养滴，再放于5%CO2、95%湿度及37℃恒温培养箱中培养至MⅠ或MⅡ期。
1.4 HDAC8的抑制处理
将HDAC8抑制剂PCI-34051以1:1000的配比稀释于M2及M16培养滴中，然后将此培养滴用于卵母细胞的培养。对照组培养滴不添加抑制剂。
1.5 siRNA显微注射
1.5.1 样品 将GV期卵母细胞移至含2.5μM milrinone（抑制GV期卵母细胞）的M2培养滴中，以用于注射5-10 pl的HDAC8-morpholino或control-morpholino（MO）。MO的工作浓度为1mM。其中HDAC8-morpholino的基因序列为5′-GCCCUGCAUAAACAAAUGATTUCAUUUGUUUAUGCAGGGCTT-3′，control-morpholino的基因序列为5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3′。
1.5.2 显微注射 检查并调整显微操作仪的工作状态之后，将卵母细胞移至培养皿盖中的预热M2培养滴（含2.5μM milrinone），加入石蜡油密封培养滴。然后将其置于显微操作仪的倒置显微镜下进行显微注射。