好氧降解木质素化合物的海洋微生物分离与鉴定(3)
1 材料与方法
1.1供试材料
海水或海底泥沙，试剂化合物，培养基。
1.1.1 海水
海水取自连云港海水和海底泥沙。
1.1.2 试剂化合物
（1）普通化学试剂
氯化钠等各种无机盐、香草酸等有机化合物、蛋白胨、酵母提取物等培养基试剂均从上海生工生物科技有限公司（上海，中国）购买。
（2）分子生物学试剂
DNA连接酶、限制性内切酶等试剂、PCR扩增试剂盒、T-载体（pUCm-T）、扩增16S rDNA的上游引物Ecoli16S-27F（5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’），下游引物Ecoli16S-1492R（5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’）均从上海生工生物科技有限公司购买。
1.1.3 培养基
（1）海水液体培养基ONRTa：
Solution A:22.79 g NaCl，0.72 g KCl，3.98 g Na2SO4， 47.2 mg Na2HPO4，0.27 g NH4Cl，83 mg NaBr， 27 mg H3BO4，31 mg NaHCO3，1.3 g TAPSO，2.6 mg NaF， 890 ml H2O。pH=7.6。使用高压灭菌锅灭菌。
Solution B: 1.46 g CaCl2﹒2H2O，11.18 g MgCl2﹒6H2O， 24 mg SrCl2﹒6H2O，100 ml H2O。使用高压灭菌锅灭菌。
Solution C:0.02 g FeCl4﹒4H2O，100 ml H2O。过滤灭菌。
按照Solution A 890 ml，Solution B 100 ml，Solution C 10 ml的比例混合配制海水培养基。需要时加入碳源(0.2%香草酸)。制备固体培养基时需加2.5%琼脂条。
（2）富集培养基
0.2 g胰蛋白胨，0.1 g酵母提取物，加入海水培养基100 ml混匀。使用高压灭菌锅进行灭菌（注：Solution C 只能过滤灭菌，不能高压灭菌）。制备富集固体培养基的时侯需要在原有培养基的基础上加入2.5% 琼脂条。
1.1.4 各种试剂溶液的制备
（1）与琼脂糖凝胶电泳相关的试剂制备
50×TAE缓冲液：称量37.2 g Na2EDTA•2H2O，244 g Tris，并将其放置在1 L烧杯中；再向烧杯中加入去离子水约800 ml，使用玻璃棒充分搅拌均匀；继续加入冰乙酸（57.1 ml），混匀，使其充分溶解；然后使用去离子水使其定容至1 L后，并用少量NaOH调pH至8.5，使用高压灭菌锅进行灭菌，最后室温保存。
1×TAE缓冲液：用量筒量取20 ml 的50×TAE溶液再加入去离子水(约980ml）使其最终定容至1000 ml。
琼脂糖凝胶：在100 ml 1×TAE溶液中加入1 g琼脂糖，使用微波炉进行加热,使其完全溶解。