百萨偃麦草染色体5J特异标记的开发与应用(2)
在禾谷类作物的比较遗传研究中，水稻的基因组是一个很重要的模式基因组。Yu等(2004)[9]利用普通小麦特异标记和supercluster analysis开发了155个EST-SSR特异标记引物，其中74个EST-SSRs (53%)在水稻跟小麦当中都成功扩增出来，这些标记可以用于比较作图,其中与小麦第五部分同源群存在共线性关系的有15个。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是地中海和中东的一种本地野生草本，现在其基因组已完成测序。用短柄草、水稻和高粱基因组进行的比较基因组研究，为了解草本基因组演化提供了线索，并且还将有助于将来对大的、复杂的基因组（如小麦的基因组）进行分析。Sachin等(2012)[10]利用Blastn将8210个在小麦基因组上定位的wESTs与短柄草的基因组进行比对分析，高达5208wESTs在短柄草的五个染色体组上（Bd1至Bd5）显示为高度相似。利用这些wESTs在小麦的七个同源群进行定位，能够表现短柄草与小麦的共线性关系，其中小麦的第五部分同源群与短柄草的Bd4共线性最高。
Tiwari等(2015)[6]利用流式细胞术分析和分拣植物染色体技术[11]，将Aegilops geniculata的5Mg染色体在普通小麦-Aegilops geniculata二体代换系中分离出来，利用二代测序技术（NGS）进行转录组测序，预测了4236个转录子，通过与大麦，短柄草，水稻，高梁，普通小麦五种作物的基因组比对，分别发现了1755, 1987, 1375,1270 和 3045具有直系同源的转录子，其中有602个在五种作物中都存在同源性，证明5Mg与五种作物具有良好的共线性。转录组测序为了解百萨偃麦草基因表达特点、开发特异染色体标记提供了新的途径，但现有的百萨偃麦草转录组序列尚未得到深入的发掘[7]。根据禾谷类作物的共线性，普通小麦跟百萨偃麦草比对分析，可以获得大量的同源位点，有利于更好地开发百萨偃麦草5J染色体特异标记，加密物理图谱，促进有利基因的挖掘。本研究旨在将转录组分析与染色体工程相结合，加快功能标记的开发，同时，利用染色体工程诱致的系列变异体，为物理图谱构建和目标基因的精细定位提供帮助，在创造新种质的基础上，为发掘重要功能基因提供信息。
Bowtie是一个超级快速的，较为节省内存的短序列拼接至模板基因组的工具。它在拼接35碱基长度的序列时，可以达到每小时2.5亿次的拼接速度。Bowtie并不是一个简单的拼接工具，它不同于Blast等。它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取1024个碱基的片段，非常适合下一代测序技术。本研究旨在利用Bowtie，将百萨偃麦草转录组测序获得的序列与小麦第5部分同源群染色体进行比对分析，鉴定与小麦高度保守的序列开发EST-SSR引物，以筛选5J特异的分子标记用于染色体工程，研究还拟对前期选育出的涉及5J的变异体进行鉴定，并初步定为标记所在的染色体区段，并比较5J染色体与小麦第5部分同源群染色体的共线性特点。
1 材料和方法
1.1 材料
材料包括中国春、百萨偃麦草、中国春-百萨偃麦草双二倍体和中国春-百萨偃麦草代换系DS5J(5A)，均由南京农业大学保存，5J变异体包括15YJ1-3-2.3、15YJ1-4-6.2、16YJ1-4-6.6-3、14WyzFS4343-2-7-2、14Wyz57-5-3、16YJ125-34、16YJ1-3-2.3-6、16YJ1-6-3.3-6、16YJ1-6-3.3-4、16YJ127-9、16YJ1-6-3.3-5和16YJ113-26，由杨骄提供。
1.2序列比对与引物设计方法
采用bowtie比对工具，将百萨偃麦草转录组EST与小麦第五同源群基因组数据进行比对，参数设置为bowtie软件默认参数。引物设计方法：采用Primer3和Misa，参考比对出的同源序列设计引物，开发的标记类型为EST-SSR标记，引物长度为18-20bp，退火温度为53℃。
上一篇：水稻粉质突变体F41的基因定位