5个转灰飞虱CYP基因果蝇品系的建立和定量PCR验证(5)
6）加入500μl异丙醇，以沉淀RNA，缓慢上下轻柔颠倒几次混匀，然后置于冰上10 min；
7）4℃，12,000g离心10min，迅速弃掉上清液；
8）加入1ml的75%乙醇溶液，涡旋片刻，使之与壁分离，然后于4℃，7500g离心5 min，用移液枪小心去除上清液；
9）可重复步骤7一次；
10）空气或真空干燥5~10min，加40μl无RNase的水（RNase-free water），用枪头 吸打均匀。-70℃贮存备用。
11）RNA质量及浓度检测：用0.1%的DEPC水配制0.5×TBE电泳缓冲液，0.8%的琼脂 糖凝胶电泳检测RNA的质量；紫外分光光度计对RNA进行浓度和质量检测，OD 值在1.6~1.8之间为理想值。
（2）cDNA第一链合成：依据TAKARA TM 反转录试剂盒说明进行cDNA第一链的合 成，操作如下：
1）首先在无菌的PCR管中依次加入：
Total RNA 2.0μl
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl
gDMA Eraser 1.0μl
RNase Free dH2O up to 10 μl
Final volume 10 μl
2）将上述混合物放置于于PCR仪42℃2min 4℃保存；
3）然后在第2步PCR管中加入下列反转录反应液（20 μl）：
5×PrimeScript Buffer 2(for real time) 4.0 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I
1.0 μl
RT Primer Mix 1.0 μl
步骤1的反应液 10.0 μl
RNase Free dH2O up to 20 μl
Final volume 20 μl
4）将上述混合物于PCR仪中完成逆转录过程：37℃保温15 min，85℃保温5sec，4℃ 保存。合成的cDNA置于-20℃贮存备用。
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