水稻响应镉胁迫转录因子（OsNAC300）功能研究(3)
1 材料与方法
1．1 研究材料
本研究以水稻野生型日本晴(ssp. japonica cv. Nipponbare)及本实验室新发展的转基因植株（OsNAC300p:GUS；OsNAC300过表达植株）为研究材料。
1．2 研究材料培养
选取饱的水稻种子，置于自来水中黑暗条件下30°C浸泡72 hr，至种子露白；挑选露白情况一致的种子，漂浮在0.5 mM CaCl2溶液(具孔浮网)上于30°C，黑暗条件下（锡纸遮光）72 hr育根；换用1/2 木村B完全营养液培养，置于光照培养室(光照周期为：光照/黑暗=12 hr/12 hr，温度为30°C)。
1．3 试剂
1/2木村B完全营养液(终浓度，去离子水溶解 pH 5.5)
Macro elements：
KH2PO4, 0.091 mM；MgSO4•7H2O, 0.273 mM；(NH4)2SO4, 0.182 mM；
KNO3, 0.091 mM；Ca(NO3)2•4H2O, 0.183 mM。
Micro elements：
H3BO3, 3 μM；MnCl4•4H2O, 0.5 μM；(NH4)6Mo7O24•4H2O, 1 μM；
ZnSO4•7H2O, 0.4 μM；CuSO4•5H2O, 0.2 μM；Fe3+-EDTA, 20 μM。
磷酸缓冲液（pH 7.0）NaH2PO4•2H2O, 78 mM；Na2HPO4•7H2O, 122 mM；
Na2EDTA溶液 50 mM；
K3[Fe(CN)6]溶液 40 mM；
K4[Fe(CN)6]溶液 40 mM；
CdCl2溶液 50 mM；
1．4 分析检测
1．4．1 OsNAC300过表达材料镉胁迫下生长指标的测定
（1）处理。选取生长正常、一致的幼苗分组进行处理，设置0、0.5、5和50 μM四种浓度镉处理；取50 mM CdCl2加入1/2 木村B完全营养液培养中，配制四种浓度镉处理的营养液；每种浓度镉处理设置NIP、NAC300-OE5和NAC300-OE6三组，每组设置三个重复，每个重复移栽2株水稻幼苗，置于光照培养室(光照周期为：光照/黑暗=16 hr/8 hr，温度为30°C)，处理72 hr。
（2）取样。将植株地下部分用5 mM CaCl2涮洗4次，擦拭干净，并用直尺测量每株水稻幼苗地上部和地下部长度。分离植株的地上部分和地下部，将每个重复的地上部分和地下部分分别放入两个牛皮纸信封中，置于80°C烘箱烘干72 hr，并称量每个重复的地上部分和地下部分干重。
1．4．2 消煮
（1）冷消煮。将称重后的样品加入已洗净、烘干的消煮管中。在通风橱中配制V(HNO3):V(HClO4) = 87:13的比例的混酸，向每根消煮管中加入5 ml混酸，并用保鲜膜封住管口，在通风橱中静置12 hr。
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