酵母双杂交载体的Gateway改造(2)
由于传统的酶切-连接技术要求严格，步骤较复杂，容易出错，成功率不高。 Gateway技术是在噬菌体的位点特异重组反应的基础上，目的片段添加重组位点，将PCR产物与含有重组位点的供体载体相混合，进行BP反应来获得入门载体 (entry clone)，入门载体可以和不同用途的目标载体进行LR反应获得相应的表达载体，该技术不再使用限制性内切酶和连接酶[5-7]。因此本试验利用gateway技术改造酵母双杂交载体可极大的方便酵母双杂交载体的构建。
1.材料与方法
1.1 主要材料
1.1.1 所用载体：
酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7来自colontech pDONR207， pBS-Gateway-rfA来自Thermal（Invitrogen）
1.1.2 菌株：
大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DB3.1感受态细胞由周口师范学院植物遗传与分子育种实验室提供。
1.1.3 酶及试剂：
T4DNA连接酶和内切酶购自NEB公司； DNA Marker购买自北京全式金生物技术公司；质粒提取试剂盒和胶原回收试剂盒购买自艾德莱生物科技公司。
1.2 主要设备
高速离心机；培养箱；水浴锅；电磁炉；制冰机；摇床等。
1.3 实验方法
1.3.1 酶切：
以检测为目的酶切用15微升体系，配比见下，放置于37℃培养箱1小时以上。
Buffer 1.5微升
质粒 5微升
酶I
0.2微升
酶II
0.2微升
补水至15微升。
以构建载体为目的酶切用50微升体系，配比见下，放置于37℃培养箱2小时以上
Buffer 5微升
质粒 20微升
酶I
2微升
酶II
2微升
补水至50微升。
1.3.2 连接：
用NEB T4 ligase，10微升体系，配比如下， 16℃，过夜培养。
Insert 6微升
Vector 2微升
T4 ligase buffer 1微升
T4 ligase 1微升
1.3.3 酶切、胶回收：
按照其实验说明书操作。
1.3.4 大片段补平：
用NEB公司klenow大片段，使用参照其说明书
1.3.5 大肠杆菌转化：
-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞加入目的DNA轻混匀，放在冰上30分钟。然后将感受态在42℃水浴锅中将感受态热激1分钟，拿出后立即放置于冰上2分钟。无菌条件下，感受态中加入600微升LB(不含抗生素)混匀后37℃摇床45分钟。在无菌条件下，将菌液均匀涂布到含有相应抗生素的LB固体培养基上，待完全吸收平板上的菌液后，将平板倒置于37℃培养箱培养过夜。
2.结果与分析
2.1酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7的酶切和补平
经分析pGADT7和pGBKT7用BamH I单酶切，补平后不影响读码框。所以选用BamH I将这两个质粒单酶切，然后切胶回收。回收后产物Klenow大片段补平，纯化为Vector