甘薯基因不同转录本表达量的初步分析(2)
甘薯作为异源多倍体植物，是研究被子植物多倍化后基因组行为的较好模式植物，但前人研究未深入涉足甘薯转录本的分析 工作，也对甘薯转录本间剂量关系做详尽解释。为推进这一领域的研究，本文用RNA-seq 的方法得到95个品种的甘薯的基因转录本数据，同时利用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million MappedReads）值表示对应Transcript的表达丰度。对于拥有多个转录本的基因，本文根据基因转录本所示的基因表达量对包含相同数目转录本的基因做分组汇总，然后针对基因不同转录本间的剂量关系进行数量分析，最后对不同转录本表达量分配的问题作出关于甘薯基因表达与进化方面的猜想与展望。在转录本数据的处理上，本文主要使用Excel表格在转录本数据上直接进行分类数据处理，通过对95个品种基因表达量得计算与作图，探究表达量在不同转录本之间的关系。在数据计算的过程中，本文先后参照不同统计学的经典计算方法对各个转录本数据进行分组后，通过计算结果与最终柱状分布图的表现情况综合评定其优劣，选择了最适用于大量基因转录本初步分析的计算方法。
1材料与方法
1.1甘薯RNA文库构建与文库质控
多倍化导致新物种的形成，在这个过程中伴随着基因转录本剂量的调整，甘薯基因转录本个数从零到数百不等，本文使用HiSeq2500对构建的RNA文库进行高通量测序。本文将甘薯幼叶、成熟叶、根、茎等组织混合以从中提取RNA，分别采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性等，以保证使用合格的样品进行转录组测序。样品检测合格后，进行文库的构建。先用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，然后加入fragmentation buffer将mRNA进行随机打断后，以mRNA为模板，用吹冰碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA。用AMPure XP beads对纯化及进行末端修复、加A尾并连接测序接头后的双链cDNA进行片段大小选择，最后，通过PCR富集得到cDNA文库。 在得到cDNA文库后，为保证文库质量，对文库的浓度进行检测是使用Qubit2.0和Agilent 2100进行的，同时我们使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量。