第三章 克隆载体的构建

   从蝌蚪视顶盖获取目的基因—HDAC1，经RNA提取、逆转录成cDNA模板`吹冰^文:论;文'网www.chuibin.com，cDNA经PCR扩增回收后连接PTA2克隆载体，转化抽提后筛选重组子进行酶切、测序鉴定其准确性。

3.1材料

PTA2空载、KOD Plus 、TA克隆试剂盒（日本TOYOBO公司）；感受态菌株E.cori Top 10（-80°C保存）；RNA抽提、凝胶回收试剂盒（美国Axygen公司）；DM5000 DNA Marker、质粒小抽试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；逆转录酶（美国BIO-RAD公司）；限制性内切酶、T4连接试剂盒（美国Thermal公司）；Trptone、Yeast Extract、Nacl、Agar（上海生工生物技术有限公司）；3-氨基-苯甲酸乙酯（MS222）（意大利Sigma-Aldrich公司）

主要仪器

   连续变倍体视显微镜：SMZ1500 Nikon(苏州欧米特光电科技有限公司)小型离心机（Eppendorf centrifuge 5424）；PCR仪（BIO-RAD C1000 Touch TM Thermal cycler）；凝胶成像系统（BIO-RAD GelDoc XR+Gel Imaging System）；细菌培养箱（美国Thermal公司）；超净工作台（上海博讯 SW-CJ-2FD）

自配试剂：

MS222：500mL Steinberg’s Solution和0.1g MS222 powder混匀，调节pH至7.4。

3.2 方法

蝌蚪用0.02％的MS-222进行麻醉后，收集视顶盖，提取总RNA（详细步骤参考Axrgen公司Axy Prep Mulitisoure Total RNA Miniprep Kit的说明书），电泳鉴定RNA质量后，将RNA逆转录成cDNA，对所获cDNA模板进行PCR扩增。

引物序列（由Primer Primer 5.0软件设计，上海生工生物技术有限公司合成）：

HDAC1 F：CGG AAT TCA TGG CGC TGA GTC AAG GAA C