外源L-抗坏血酸对Cr6+胁迫下小麦根际pH值和有机酸分泌的影响及其缓解机理研究(3)
1.3.4 有机酸的收集和测定
1.3.4.1 有机酸的收集、纯化和浓缩
处理后 8 d 后开始收集根系分泌物，将小麦植株用自来水和蒸馏水冲洗数次后，用吸水纸吸干，放到含有 50 ml 双蒸水的烧杯中，在光照培养箱中培养收集 12 h ，培养收集完毕后，用双蒸水冲洗根系表面数次，合并冲洗液并定容至 100 ml ，此溶液即为收集到的根系分泌物。收集液采用冷冻干燥技术浓缩至 5 ml ，保存于 -20 ℃ 冰箱中待测。
1.3.4.2 有机酸的测定
本实验共测定草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乙酸 5 种有机酸。取小麦植株鲜样 1.0 g ，加入 5 ml 超纯水冰浴研磨，提取液在 80 ℃ 水浴震荡 1 h ，然后 10000 r / min ，离心 15 min ，上清液过 0.45 m 滤膜，有机酸含量用 HPLC 测定，柱温：30 ℃ ；流动相为含 1 % 甲醇的 20 m M KH2PO4（ pH 2.8 ）缓冲液；流速为 0.6 ml / min；波长 214 nm ；进样量：20 l。
1.3.5 小麦根系分泌有机酸对 Cr6+ 络合效应
采用平衡透析法：将 20 ml 有机酸（第 8 d收集）装在透析袋（MW = 200）内，接着浸泡在 200 ml 100 mol . L-1 Cr6+ 溶液中，12 h后取出透析袋，在去离子水中平衡 12 h ，重复 3 次。去除游离的 Cr6+，将透析袋内的液体倒出，加浓 HNO3 10 l / ml ，定容至 50 ml ，测定透析袋内 C r的浓度。
1.3.6小麦根系分泌的有机酸清除 DPPH （2,2-diphenyl-1-piCrylhydrazyl,二苯代苦酰基）自由基作用
分别吸取 2.5 ml 不同处理的小麦根系分泌的有机酸溶液，蒸馏水稀释到 5 ml ，加入5 ml 1 m mol.L-1 DPPH 自由基溶液，混合后振荡 1 min ，室温反应 30 min ，以无水乙醇作为空白， 517 nm 波长下测定吸光度（ A1 ），每组平行测定 3 次，取平均值。
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