保温结束后，取全部的PCR产物与适量的loading buffer混匀后用1%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收相应条带。

表2-1 PCR反应体系

Table2-1 PCR reaction system

试剂 用量/μl

DNA 1

KOD-Plus-Neo 1

10xPCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5

dNTP 5

25mM MgSO4 2.4

CR1386 1

CF94 1

ddH2O 33.6

总体系 50μl

2.4 扩增片段与T载体的连接

先用Axyprep DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按照试剂盒说明书进行操作。取5μl胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测其浓度。

T-A克隆采用TakaRaT-A克隆试剂盒。取4μl回收的DNA与1μl载体pMD18-T Vector混合，再加入SolutionⅠ5μl，混匀后，放置于4℃连接过夜。

2.5 目的菌落的培养

从-80℃冰箱中取出感受态大肠杆菌DH5α，在冰上融化后加入50μl连接产物，混匀后，在冰上放置30min，之后立即在42℃水浴中热激30s，然后在冰上放置2min。此时转化已完成。加入SOC培养基500μl，在摇床上进行预培养60min（37℃、200r/min）。所有操作应在超净工作台上完成源!自`吹冰'文"论(文`网[www.chuibin.com，确保无杂菌污染。

取出事先倒好的含有AMP的LB平板，在超净工作台上吹干，加入X-Gal（5-溴-4氯-3吲哚-β-D半乳糖苷）40μl、IPTG（50mg/ml）16μl，用涂布棒涂匀整个平板，避光晾干以使药品渗入培养基。将预培养好的感受态细胞4000r/min低速离心30s，吸出部分上清液，将剩余的液体与沉淀的细胞吹打混匀后，吸到平板上，充分涂布。用封口膜将平板封上，37℃倒置培养过夜。

2.6 挑选目的菌落并进行PCR

根据蓝白斑筛选原理，成功导入质粒的菌落将呈白色，因此挑取白色菌落若干，并在另一平板上划线作为备份。将挑取的菌落放入事先配好的PCR反应体系中（表2-2），以相应的纯化DNA作阳性对照，ddH2O作阴性对照。进行PCR（95℃预变性10 min； 95℃变性30s；56.2℃退火30s；72℃ 延伸45s，25个循环；72℃延伸10min；12℃保存。）。PCR完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳。