黄瓜CsAFB基因影响拟南芥盐胁迫耐受性的研究(4)
1.1.4 盐胁迫下幼苗根的生长情况统计
①将适量的拟南芥种子置于1.5 ml的离心管中，盖紧并分别标记。
②于超净台中操作：分别用枪头吸取1 ml 70%酒精加入离心管中混匀，3 min后小心吸除。
③分别加入1.5 ml 10%NaClO混匀，10 min后吸除。
④加入1 ml无菌水吹洗种子4~5遍，注意每次加入时要使无菌水与种子充分接触。
⑤4~5遍后加入1.5 ml无菌水静置，8 min后除去水，再用无菌水清洗1~2遍。注意有一些种子会漂浮在水中，在洗的过程中用移液枪慢慢吹打，并注意更换吸头，避免交叉污染。
⑥剩余约1 ml水，用灭菌的1 ml移液枪适量吸取种子并将表面消毒后的种子呈颗粒数点在含NaCl（300 mM）的B5培养基上进行培养。每个株系80颗种子，透气胶带封口后置于4 ℃的冰箱中春化2 d，破除种子休眠。
⑦将含有打破休眠后种子的培养皿置于光放置光照培养室内培养，光照强度是10000 lx，恒湿60%，恒温22 ℃。
⑦在光照培养室种培养5 d后，分别选择生长状况相似的幼苗移到含NaCl的B5培养基上进行培养，并设置不加NaCl的对照组，每个株系20棵幼苗，每隔1 d统计一次根的生长状况。
⑧在含盐培养基上生长9 d后，对幼苗拍照，每组实验重复3次。
1.1.5 盐胁迫下土培苗生长状态统计
①将适量的拟南芥种子置于1.5 ml的离心管中，盖紧并分别标记。
②于超净台中操作：分别用枪头吸取1 ml 70%酒精加入离心管中混匀，3 min后小心吸除。
③分别加入1.5 ml 10%NaClO混匀，10 min后吸除。
④加入1 ml无菌水吹洗种子4~5遍，注意每次加入时要使无菌水与种子充分接触。
⑤4~5遍后加入1.5 ml无菌水静置，8 min后除去水，源`自,吹冰`文.论"文'网[www.chuibin.com再用无菌水清洗1~2遍。注意有一些种子会漂浮在水中，在洗的过程中用移液枪慢慢吹打，并注意更换吸头，避免交叉污染。
⑥剩余约1 ml水，用灭菌的1 ml移液枪适量吸取种子并将表面消毒后的种子呈颗粒数点在含NaCl（300 mM）的B5培养基上进行培养。每个株系80颗种子，透气胶带封口后置于4 ℃的冰箱中春化2 d，破除种子休眠。
⑦将含有打破休眠后种子的培养皿置于光放置光照培养室内培养，光照强度是10000 lx，恒湿60%，恒温22~24 ℃。
⑧将生长10 d的幼苗（具两到四片子叶，根长1~2 cm）移入土壤中栽培。
将腐殖质土壤与珍珠岩按2:1比例加入灭菌锅内，并加入足量营养液，浸润混匀后进行湿热间歇式灭菌，以杀死可能存在于土壤混合物中的各种害虫，待土壤混合物灭菌冷却之后装入已剪好并标记的底部漏口的塑料花盆中，稍稍压实。将各花盆紧密排列于托盘中，并于底部加入约1/2新鲜配制营养液，浸泡约1 h，靠毛细管作用浸湿介质，充分湿润土壤混合物。
用镊子在土壤中部挖适当大小的洞，将培养基上的幼苗小心夹出，去除粘附在根上的培养基，保持根部垂直嵌入小孔，拨土将根掩埋，苗挺直，叶片朝上，若不直，用珍珠岩轻压直立。移苗完成后，托盘加塑料盖有机罩，以提供幼苗发育所需的高湿度，并端至光照培养箱内培养。
⑨两天后，幼苗恢复生长，去除有机塑料罩。
⑩实验组每隔天浇灌添加300 mM NaCl的霍格兰氏营养液，对照组只浇灌霍格兰氏营养液，持续观察实验组和对照组幼苗的生长状态，两周后拍照保存，重复3次。