几种高温DNA聚合酶性质比较+文献综述(5)
图1-3 融合了Sso7d蛋白的DNA聚合酶的结构
如图1-3所示，融合了Sso7d蛋白后，在DNA复制时DNA聚合酶在模板上移动时获得了一个牢固的把手。因为将Sso7d以融合蛋白的形式与A族或B族的DNA聚合酶结合后，Sso7d蛋白对双链DNA具有较强的亲和力，可以识别PCR反应过程退火后的双链DNA，从而协助DNA聚合酶快速识别延伸的起点，极大的地增强了原DNA聚合酶的延伸速率[33]。此外，融合后的DNA聚合酶和双链DNA之间的作用也相对减弱，因此DNA聚合酶在DNA双链上移动的速度也相对加快。而且，经Sso7d蛋白融合修饰的聚合酶对于PCR抑制剂的抵抗能力得到了很大提升。
2 DNA聚合酶的提取与纯化
2.1 DNA聚合酶的提取
实验及工业生产中，从大肠杆菌中提取表达的酶蛋白，主要是通过细胞破碎技术，将胞内的蛋白释放出来。
细胞破碎技术[34]是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质的基础。目前，已发明了多种方法进行细胞破碎，以便适应不同类型和不同用途的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类，机械法主要包括珠磨、高压匀浆、超声破碎及X-press法等，非机械法主要包括酶溶、化学渗透、冻结融化及干燥法等，各种方法的作用原理及适应性如表2-1所列。
表2-1 细胞破碎方法
分类 作用机理 适应性
珠磨 固体剪切
作用 较高的破碎率，可大规模操作；
大分子目的产物易失活，浆液分离困难
高压
匀浆 液体剪切
作用 较高的破碎率，可大规模操作；
不适于丝状菌和含有包涵体的基因工程菌
超声
破碎 液体剪切
作用 较高的破碎率，时间短，效率高，适于实验室和工业生产；
需要高能量，产生高温，引起产品变性失活，非专一性，分离困难
X-press 固体剪切 较高的破碎率，活性保留率高；浆液分离困难
酶溶 酶降解作用 专一性高，抽提速率和收率高，产品破坏少，不残留细胞碎片，
易于分离；但费用高，通用性差，不适于工业生产
化学
渗透 改变细胞膜
渗透性 有一定的选择性，不需要特殊设备，细胞外形保持完整，
细胞碎片少，利于后续分离；通用性差，时间长，
效率低，某些化学试剂有毒
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