摘  要：弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性蛋白为特征的广谱肽链内切酶，广泛应用于医疗卫生、食品加工、日用化工及环境治理等行业，具有极大的经济价值和应用前景。本研究主要是用基因定点突变、PCR技术、质粒提取以及琼脂糖凝胶电泳等分子生物学手段，通过引入N-糖基化位点，来研究N-糖基化位点对重组弹性蛋白酶在毕赤酵母中表达量的影响。55614

毕业论文关键词：弹性蛋白酶，N-糖基化位点，定点突变，毕赤酵母

Abstract: Elastase is a kind of broad spectrum endonuclease peptide chain, which is characterized by hydrolysis of insoluble elastin. It is widely used in many industries such as health care, food processing, household chemicals and environmental management. It has great economic value and application prospect. The thesis mainly use molecular biology such as gene site-directed mutation, PCR technique, plasmid extraction, and agarosegel electrophoresis introduced N-glycosylation sites to study the influences of N-glycosylation sites on the elastase expression in Pichia pastoris.

Keywords: elastase, N-glycosylation sites, site-directed mutagenesis, Pichia pastoris

目  录

1 前言 3

2 实验材料 4

2.1 质粒和菌株 4

2.2 酶和试剂及各试剂配制方法 4

2.2.1 酶和试剂 4

2.2.2 试剂配制方法 4

2.2.3 培养基配制方法 5

2.3 实验仪器 5

3 实验方法 6

3.1 PCR定点突变引入糖基化位点 6

3.1.1 PCR引物设计规则： 6

3.1.2 设计引物 6

3.1.3 PCR 6

3.1.3.1 PCR反应体系 7

3.1.3.2 PCR循环 7

3.1.3.3 消化模板 7

3.2 大肠杆菌(DH5α)感受态制备和目的基因的转化 8

3.2.1 感受态制备 8

3.2.2 转化 8

3.3 摇瓶培养提取质粒并测序 8

3.4 目的基因的亚克隆 9

3.4.1 提取质粒 9

3.4.2 双酶切 9

3.4.2.1 EcoRI酶切 9

3.4.2.2 乙醇沉淀DNA 9

3.4.2.3 AvrII酶双酶切 9

3.4.3 连接 10

3.5 再次转化筛选阳性克隆 10

3.5.1 电转化毕赤酵母 10

3.5.1.1 毕赤酵母感受态制备 10

3.5.1.2 将成功筛选出的菌种质粒用SacI酶切处理线性化 11

3.5.1.3 电击转化 11

 3.5.2 毕赤酵母诱导产酶培养 11

3.5.3 蛋白酶的测定 11

3.5.4 SDS-PAGE电泳 11

3.5.4.1 制备双层凝胶 11

3.5.4.2 SDS-PAGE胶染色