2  材料与方法文献综述

2.1  土样

在青藏高原的唐古拉山采集土壤样本5份。每份按照土壤微生物分析的取样原则用五点混合取样法采集土壤，混合均匀后装入灭菌的自封袋中。所有取样和运输过程都保持无菌，样本采集后低温运输至实验室在-20℃下保存。

2.2  培养基与试剂

YPD琼脂斜面培养基：10.0 g/l酵母粉，20.0 g/l蛋白胨，20.0 g/l葡萄糖和20.0g/l琼脂。

液体YPD培养基：10.0 g/l 酵母粉，20.0 g/l蛋白胨和20.0 g/l葡萄糖。

玉米浆培养基：5.0 g/l玉米浆。

产纤维素酶培养基：玉米浆1.6 g/l，CoCl2·6H2O 0.2 g/l，(NH4)2SO4 1.4 g/l，KH2PO4 2.0 g/l，MgSO4 0.3 g/l，预处理秸杆40.0 g/l，尿素 0.3 g/l。

以上培养基115 ℃高温高压灭菌，冷却后备用。

纤维素酶的测定试剂

DNS：分别称取19.8 g NaOH及10.6 g 3, 5-二硝基水杨酸（DNS）溶于1416.0 ml蒸馏水后，加306.0 g酒石酸钾钠、7.6 ml苯酚（50 ℃熔化）及8.3 g偏重亚硫酸钠。

柠檬酸缓冲母液：柠檬酸21.0 g ，蒸馏水75.0 ml，氢氧化钠4-6 g（滴加直到pH 4.8）

柠檬酸缓冲工作液（以下称柠檬酸缓冲溶液）：柠檬酸缓冲母液与蒸馏水按：1:19的比例进行稀释，之后用NaOH溶液调节pH至4.8。

CMC-Na（2% w/v）溶液：称取2.0 g CMC-Na，加入约80 .0 ml柠檬酸缓冲溶液（50 mM， pH4.0），50 ℃水浴中搅拌溶解，完全溶解后定容至100.0 ml，贮存于冰箱中备用。该溶液保存时间不超过1个月。

菌体生物量测定试剂：1 mol/l的HClO4，现配现用（限当天使用）。

2.3  主要实验仪器

分析天平、恒温培养箱、恒温振荡器、恒温水浴锅、分光光度计、pH计、显微镜等。

2.4  实验方法来`自^吹冰论*文-网www.chuibin.com

2.4.1  菌种分离

（1）取土样置于锥形瓶中，加入无菌水，在摇床振荡30 min后，取上清，在试管中稀释成不同浓度。

（2）将稀释后的上清涂布至YPD固体平板，30℃静置培养，直至有菌落出现。

（3）根据其菌落形态，挑取不同形态的单菌落，保存至YPD斜面。

2.4.2  菌种的菌落及细胞形态鉴定

菌落形态学鉴定，通过肉眼观察菌落形态，并在显微镜下观察细胞形态，与已知菌种进行比较，初步筛选出高产纤维素酶的可能菌株。