1。2。2 水稻叶片DNA的提取

图位克隆时，使用SSR分子标记对应的引物对基因进行PCR扩增，基因片段的长度不长，因此对DNA的要求不高，采用SDS法提取。

具体步骤：

1）磨样：取0。1g左右的新鲜水稻叶片，剪碎放入1。5ml的EP管中，加入液氮，充分磨碎后，加入65℃预热的SDS提取液300μl，充分震荡，是叶片粉末与提取液充分接触，75℃恒温水浴30min，每隔10min摇晃一次，使叶片粉末与提取液充分反应。

2）加入300μl酚氯仿溶液，轻微震荡混匀，75℃水浴15min，期间轻微摇晃数次，有助于液相和有机相的分离，使蛋白质等杂志与DNA充分分离。

3）12000rpm，离心5min，用移液枪吸取上清（300μl左右，千万不要吸到下层沉淀）至一新的EP管中，加入300μl预冷的异丙醇，上下颠倒数次混匀，4℃静置5-10min。

4）12000rpm，离心5min，弃上清。来*自~优|尔^论:文+网www.chuibin.com +QQ752018766*

5）加入75%的乙醇1ml，洗涤DNA沉淀，8000rpm离心5min，倒去乙醇。

6）将EP管放于超净台中，至无乙醇残留，加入200μlddH2O，溶解DNA，于-20℃保存备用。

SDS提取液配方：100ml 1M Tris-Hcl（PH8。0）

100ml 0。5M EDTA（PH8。0）  100ml 5M NaCl 62ml 20%SDS                     

溶于1L ddH20中

1。2。3 目的基因PCR扩增

 图位克隆时扩增的基因片段短，不需要保真度高的酶，使用欣百诺公司的PCR预混MIX。基因克隆时，要求保真度高，采用NEB公司的Q5高保真酶。